巴西橡胶树单染色体分离及其高通量测序分析的研究

1、煤炭及含硫模型化合物生物降解转化的研究,专业： 矿物加工工程 姓名： 邵雪嫚 导师： 张明旭教授,安徽理工大学13级硕士研究生 学位论文答辩报告,报告主要内容,课题来源 立题依据 国内外研究进展 本研究的目的和意义 研究内容 研究方法和技术路线 预期目标 新颖之处 所需解决的主要问题 研究基础和条件 研究进度及经费预算,选题背景,最近几年，由于煤炭的降解机理与降解酶有着直接的关系，所以煤炭的生物降解研究主要集中在白腐菌所产生的一系列降解酶，由此也联想到通过提高酶活性和产酶量来达到高降解转化率的目的。一般来说，MnP氧化大部分酚类、胺类等底物，LiP与其互为补充，氧化相对应的物质，而漆酶不仅可以氧化胺类物质也可氧化酚类物质 9,10。微生物降解煤中有机硫研究已经取得很大的进展11-12，其中研究最多的属嗜硫菌对模型化合物DBT的降解，并且其确定了4S途径的降解机理13，对于其他含硫模型化合的研究较少，因此本课题研究了DBTO2的脱硫情况。,1.课题来源,基于基因工程构建煤炭降解工程菌降解转化煤炭的机理研究(51374014) 生物酶脱除煤炭中有机硫的机理研究（ 51474012）,2.立

2、题依据,橡胶是我国重要的战略物资。国内外已从橡胶中克隆了近420种基因或cDNA，然而这些基因基本均是从橡胶树cDNA文库或其总基因组中获得，无法确定其在橡胶树染色体上的位置和分布特点，从而导致无法进一步确定其所在的连锁群。研究者也先后发表了利用各种分子标记构建的橡胶树连锁遗传图，但均是从总基因组中获得，并存在着不同程度的连锁群不稳定，丰度小而且分布不均匀，许多功能基因在染色体组上的连锁关系和位置都不清楚，直接利用分子标记辅助橡胶树育种难度较大。,3.国内外研究进展,目前木质素降解酶已成为国内研究的热点，石开仪等人发现白腐真菌通过Lac和Lip的催化作用可以使百里酚脱酚基、脱甲基、开环、氧化等。何宝燕、尹华、彭辉等人研究了黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)对十溴联苯醚(BDE209)的降解；发现在含1mg/LBDE209的降解体系中，生物量为1.74g降解率达到最大(86.76%)；卢永等利用黄抱原毛平革菌对焦化废水进行降解研究，找到了降解的最优条件19；曾斌等研究了白腐真菌对五氯酚的降解情况 20；这些都为进一步探索微生物对有机物的降解打下了基础

3、。,研究内容,（1）紫外诱变对黄孢原毛平革菌酶活性的影响以及酶活性与降解率之间的关系。 （2）微波诱变后的诱变菌的酶活性变化以及对低阶煤的降解状况。 （3）紫外，微波处理的球红假单胞菌对DBT的降解状况及最适诱变时间。 （4）利用响应面处理的方法探索影响DBT降解效果的因素。 （5）球红假单胞菌对其他含硫模型化合物的降解。,创新点,（1）目前，对于利用紫外、微波诱变方法，筛选诱变菌种已做了大量的研究工作，但是这两种处理方法对降解酶系的活性和产量有无影响，以及降解酶活性与降解转化率之间的关系还有待于进一步探索。 （2）球红菌可以降解转化DBT已被我们所熟知，但是紫外或是微波处理后的菌种对其降解效果还未被探究。 （3）球红菌对其他的含硫模型化合有无降解能力，降解效果如何，降解产物具体是那些等问题还未被探究。 （4）首次利用响应面的方法探索了球红菌降解DBT的影响因素的最佳组合 （5）结合生物酶提纯技术，首次探索了紫外，微波诱变处理后降解酶的浓度变化与酶活性变化。.,已发表的采用高通量测序的植物全基因组 De nove 测序: 黄瓜(Cucumis sativus)（Huang S等,200

4、9） 苹果(MalusdomesticaBorkh)(Velasco R等,2010) 野生大豆(Glycine soja)(Kim M Y等,2010) 森林草莓（Shulaev V等,2011)、 可可树(Argout X等,2011) 麻风树(Jatropha curcas)(Sato S等,2011) 枣椰树(Phoenix dactylifera)(Al-Dous E K等,2011)马铃薯(Solanum tuberosum)(Xu X等,2011) 白菜(Brassica rapa)(Wang X等,2011) 大麻(Cannabis sativa)(van Bakel H等,2011) 木豆(Cajanus cajan)(Varshney R K等,2012) 蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)(Young N 等,2011) 橡胶树的全基因组 De nove 测序目前还为发布。在植物方面对植物单条染色体进行高通量测序仅在小麦的单条染色体臂（聂小军等,2013）的研究中有过报道，在橡胶树中尚未见报道。,基因组测序只能测出整个DNA的碱基对排列顺序，不能直

5、接测出DNA上的基因及其功能，必须通过生物信息学方法，结合蛋白组学、转录组学，对测出来的序列进行分析，将基因及其功能加以挖掘、注释，这称作基因注释。基因组注释主要包括四个研究方向：重复序列的识别；非编码RNA的预测；基因结构预测和基因功能注释。在国内外在植物方面已有对花生(陈华等,2009)、水稻(王宏斌等,2010)、大豆(王茵茵等,2010)、杜仲(李铁柱,2012)、构树(彭建军,2013)，拟南芥(张翔,2012,2013)等进行基因注释的相关报道。在橡胶树上的基因注释比较少。,4.本研究目的和意义,本研究采用显微玻璃针分离技术对巴西橡胶树部分染色体进行单染色体显微分离，再利用单细胞全基因组扩增法对橡胶树部分单染色体进行体外扩增，并对其第二轮PCR产物采用Illumina/Solexa高通量测序技术进行测序，进而对相应染色体的序列进行序列分析、功能注释，从而进一步明确橡胶树已知的重要功能基因和预测功能的基因在橡胶树染色体组上的位置，初步对现有的橡胶树连锁群进行归类。 本项目可为筛选橡胶树染色体特异片段、单染色体或其区段的特异探针或特异标记，为构建橡胶树单条染色体功能基因的分离和

6、定位及基因组物理图谱构建提供有效工具，从而有效的应用于橡胶树分子辅助育种。,5.研究内容,5.1巴西橡胶树热研7-33-97单染色体分离技术体系的建立。 主要通过借助显微操作仪的玻璃针分离法，进行巴西橡胶树热研7-33-97部分单条染色体分离和技术体系的优化。,5.2单条染色体体外扩增与鉴定,采用单细胞全基因组扩增法对已分离出的巴西橡胶树染色体进行体外扩增，通过Southern杂交鉴定扩增产物来自巴西橡胶树基因组，经荧光原位杂交（FISH)验证并结合核型分析确定染色体序号。,5.3巴西橡胶树单染色体PCR产物高通量测序与序列的功能注释,对已鉴定的单染色体第二轮的PCR产物进行Illumina/Solexa高通量测序，并对测序结果通过相应生物信息学分析进行其功能注释。如单条染色体测得的序列片段进行编号、片段大小分析，通过BLAST在线进行各橡胶树序列与基因库中橡胶树已知功能基因或未知基因序列比对，进一步明确橡胶树重要功能基因在橡胶树染色体组上的位置，同时对同源染色体的序列进行比对，进而分析同源染色体之间在DNA水平上可能存在的差异等。,6.研究方法与技术路线,6.1实验材料 本研究的主要

7、实验材料是：黄孢原毛平革菌，球红假单胞菌，DBT。,6.2研究方法,1紫外诱变 （1）首先打开紫外灯预热30min稳定光波 取制备好的孢子悬液各6ml于9ml的平板培养平皿中，放在磁力搅拌器上，边搅拌边照射控制照射距离30cm。辐射处理时间梯度为：0s；20s；40s；80s；120s；160s；200s；250s。所有操作必须在红灯下进行，照射后的菌体不可直接接到平板培养基上，必须转入无菌试管中并立即放入无光照的冰水中1-2h，防止细胞修复，影响实验效果。 （2）取上述诱变处理的菌悬液0.5ml均匀涂布于平板固体培养基上，四天后观察菌落生长状况，图片记录。将上述各自生长状况良好的菌落同上制成106/ml的孢子悬液，接1ml菌悬液于50ml的发酵液中，摇床培养7天后，分别取10ml样品装入小锥形瓶，加入各种酶提取用缓冲溶液（LiP采用缓冲液A，MnP采用缓冲液B，漆酶采用100mmol/L的醋酸钠缓冲液，PH5.0）振荡提取1h，150rpm。离心（4200rpm,20min），取上清液用0.45um滤膜过滤，滤液用于测定酶活。 2微波诱变 打开微波炉，选取中档功率，取制备好的106/

8、ml孢子悬液30ml与锥形瓶中，取1000ml大烧杯，其中加入蒸馏水适量，将锥形瓶放入，确保蒸馏水液面淹没锥形瓶中孢子悬液的液面。每照射20S后取出锥形瓶，用移液枪取1ml于配置好的发酵液中，然后用温度测量仪检测蒸馏水的温度，当超过40时必须换掉烧杯中的蒸馏水，如此反复操作，直到照射时间达到160S，预先设置的最大时间梯度。将处理好的发酵液放在摇床培养箱中30,120转，培养一周，取出测其酶活性49-51。,研究方法,2.3.3酶活性测定方法 (1)LiP活性测定52：采用藜芦醇法，一个酶活力单位定义为(U)每分钟氧化藜芦醇产生1mol藜芦醛所需的酶量。取0.6ml藜芦醇溶液（10mmol/L）加入1.2ml缓冲液A与1.2ml粗酶液混匀，得反应液3ml，向反应液中加入60LH2O2溶液（2mmol/L）启动反应，在310nm下测定反应1min吸光度值的变化。 （2）MnP活性测定53：一个酶活力单位(U)定义为每分钟氧化Mn2+产生1molMn3+所需酶量。取2.4ml含MnSO4(1.25mmol/L)的酒石酸缓冲液B加入0.6ml粗酶液混匀得到3ml反应液，加入60LH2O2溶液

9、（2mmol/L）启动反应在290nm下测定反应1min吸光度值的变化。 （3）Lac活性方法见文献54：一个酶活力单位定义(U)为1mol的ABTS所需的酶量，以不加启动因子的混合液为空白样。以ABTS为底物在420nm下测定3min内吸光度的变化。3ml反应液包括：缓冲液C，0.4ml粗酶液，0.6mlABTS(1.0mmol/L)55。 2.3.4降解率的测定 用紫外诱变后的平板制成106/ml的菌悬液，分别取1ml于50ml的发酵液中，置于摇床培养2天后分别加入0.4g处理过的内蒙褐煤煤样，摇床培养一周，取发酵液3500rpm离心，将离心后的上清液加盐酸，出现絮状沉淀，将沉淀干燥后称重，计算降解率56，即： =M1/M0100%(3) 式中： M0加入的每样质量g M1煤炭降解后上清液中的质量g 煤炭降解转化率% 2.3.5 2-HBP测试方法 Gibbs 试剂在弱碱性条件下可与酚羟基对位的活泼氢缩合成蓝色络合物，可用来检测酚羟基对位无取代基的化合物，0.2g的2.6二氯醌亚胺溶于200ml的乙醇溶液中，备用。 Gbbs试剂方法为：将菌液离心后，取上清液1ml加入2ml的pH9.0的缓冲液中，加入12滴20%的Na2CO3以保证反应体系中的pH9,最后加入60ul的Gibbs试剂，混匀后加入30水浴锅振荡30min,以不加上清液的作为对照，在610nm下测定光密度57。,紫外诱变白腐菌酶,酶活性检测,褐煤降解率检测,微波诱变白腐菌,酶活性检测,酶活性大小对比，最适诱变时间,6.3 技术路线,红外分析 扫描电镜分析,降解率对比，最适诱变时间,紫外，微波诱变效果大小对比分析,褐煤降解率检测,红外分析 扫描电镜分析,技术路线,紫外诱变白腐菌降解DBT,紫外诱变球红菌降解DBT,2-HBP检测,2-HBP检测,脱硫效果对比分析,球红假单胞菌降解DBT的响应面实验,响应面结果分析,7.研究成果,1）1）在紫外诱变条件下，白腐菌三种降解酶的浓度与酶活性均出现了规律的变化，酶浓度变化为LiP浓度随着诱变时间的增加，呈现先增大后减小，在40-160S之间LiP生成量较大，继续增加诱变时间时。浓度下降，推测诱变时间太长，杀

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