菌种生化反应检查标准操作程序
7页1、菌种生化反应检查标准操作规程依据:中华人民共和国药典2005年版第三部。范围:适用于大肠杆菌表达的重组人基因工程产品。 目的:通过生化试验鉴定所用的菌种是否为标准的大肠杆菌。 原理:枸椽酸盐利用试验原理:枸椽酸盐培养基中仅含一种氮源(铵盐)和唯一碳源(枸椽酸钠)一般细菌能利用磷酸二氢铵作为氮源,但不一定能分解枸椽酸盐而取得碳源,因此可否利用该盐,能将不同细菌鉴别。吲哚试验原理:有些细菌具有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚,吲哚本身没有颜色,不能直接观察,所以加入二甲基氨基苯甲醛试剂,使之与吲哚作用形成红色的玫瑰吲哚。甲基红试验原理:大肠杆菌和产气杆菌在糖代谢中都能分解葡萄糖产生丙酮酸。产气杆菌能将两个分子丙酮酸脱羧生成一个分子中性乙酰甲基甲醇,故培养物中形成酸类较少,使酸碱度PH可在5.4以上,因此加入甲基红指示剂后呈桔黄色,是为甲基红试验阴性,而大肠杆菌能进一步分解丙酮酸,产生酸类较多,使培养物的酸碱度在PH4.5或更低,故甲基红指示剂呈红色,是为甲基红试验阳性。V-P试验原理:测定细菌分解葡萄糖后能否产生乙酰甲基甲醇,产气杆菌可使丙酮酸脱羧变为中性的乙酰甲基甲醇,在碱性条件
2、下被空气中的氧气氧化成二乙酰,后者又与培养基蛋白胨中精氨酸所含胍基起作用,生成红色化合物,称为U-P试验阳性。内容:1 材料、设备11 材料:111 菌种:PBV888/DH5,来源于主种子批或工作种子批。112注射用水:符合中华人民共和国药典2005年版要求。113 试剂蛋白胨 氯化钠 NaCl 分析纯葡萄糖 C6H12O6 分析纯溴麝香草酚兰 C27H28Br2O5S 分析纯对二甲基氨基苯甲醛 C9H11NO 分析纯戊醇 C5H15O 分析纯浓盐酸 HCl 分析纯甲基红 C15H15N3O2 分析纯无水乙醇 CH3CH2OH 分析纯氢氧化钠 NaOH 分析纯氢氧化钾 KOH 分析纯-萘酚 C10H7OH 分析纯硫酸镁 MgSO47H2O 分析纯磷酸氢二钾 K2HPO4 分析纯磷酸二氢铵 NH4H2PO4 分析纯 枸椽酸钠 C6H5Na3O72H2O 分析纯琼脂粉 分析纯12 器皿盐水瓶、中试管、胶头滴管、烧杯、量筒(100ml、500ml、1000ml)、吸管(10ml)、试剂瓶(250ml、500ml)。13 仪器、设备PH计 PHC-3C型 上海大中分析仪器厂电子秤 ES-20
3、0A型 沈阳腾龙电子仪器公司 电子天平 ACS 太原恒温培养箱 HG303-5B型 湖北省黄石市医疗器械厂水浴箱 6 Liter LKB生物安全台 级A型 安徽蚌埠净化设备厂14 其它材料硫酸纸、牛皮纸、片带、橡皮膏、吸球(1ml及10ml)玻棒、接种环、透气栓。2 方法21 准备工作211 工作环境:在十万级洁净室内进行,确认场地清场合格,摘下“清场合格”标志牌,挂上“使用中”标志牌。212 器皿清洁要求经本室洗刷间处理烤干后用二层硫酸纸、一层牛皮纸包好,用线绳系紧,经121.3,60分钟高压蒸汽灭菌备用。213调试仪器设备2131 确认PH计运行状态良好,已挂有“备用”标志牌。2132 确认电子秤运行状态良好,已挂有“备用”标志牌。2133 确认电子天平运行状态良好,已挂有“备用”标志牌。2134 确认培养箱运行状态良好,已挂有“运行”标志牌。2134 确认水浴箱运行状态良好。已挂有“备用”标志牌。214溶液及培养基的配制:2141 1N NaOH 100ml摘下电子秤“备用”标志牌,挂上“运行”标志牌,接通电源,校零。用电子秤称取NaOH 4克,加注射用水80ml溶解,用量筒定容
4、至100ml,置试剂瓶中,标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期,放室温待用。2142 1%的溴麝香草酚兰(BTB)100ml摘下电子天平“备用”标志牌,挂上“运行”标志牌,接通电源,校零。用电子天瓶称取1克溴麝香草酚兰,加1N NaOH 1.6ml,加注射用水定容至100ml。置试剂瓶中,标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期,放室温待用。2143 0.4%的溴麝香草酚兰(BTB)100ml用电子天平称取溴麝香草酚兰0.4克加1N NaOH 0.64ml,加注射用水至100ml装入试剂瓶中,标明名称、浓度、体积、批号、配制日期,放室温待用。2144 95%乙醇500ml量取475ml无水乙醇,加注射用水定容500ml,装入试剂瓶中,标明名称、浓度、体积、批号、配制日期,放室温待用。2145 甲基红试剂 500ml用电子天平称取甲基红0.1克,溶于95%乙醇300ml,然后加注射用水定容至500ml,置试剂瓶中,标明溶液名称、浓度、体积、批号、配制日期,放室温待用。2146 枸氏试剂 100ml摘下水浴箱“备用”标志牌,挂上“运行”标志牌,接通电源,设定56,预热。用电子天平称取对
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