基因治疗(硕士生)

1、基因治疗的原理与进展,The Advance and Principle of Gene Therapy,基因治疗分类,体细胞(somatic cell)基因治疗 生殖细胞(germline)基因治疗,只限于某一体细胞的基因的改变 只限于某个体的当代 对缺陷的生殖细胞进行矫正 当代及子代,一、基因治疗的策略,内容提要,二、基因转移技术,四、基因治疗的应用研究,三、基因干预,（一）基因置换（gene replacement）,定义：指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。,目的：将缺陷基因的异常序列进行桥正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。,一、基因治疗的策略,基因同源重组技术,定向整合的条件:转导基因的载体与基因组DNA具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换。 基因同源重组技术又称为基因打靶(gene targeting） 细胞内基因同源重组的发生率很低。,（二） 基因添加,定义 ：或称基因增补（gene augmentation）: 通过导入外源基因使靶细胞表

2、达其本身不表达的基因。,类型: 在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能； 向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。,（三）基因干预 基因干预（gene interference）: 采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。,（四）自杀基因治疗 原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。,应用：恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。,自杀基因的作用机制,TK/GCV 单纯疱疹病毒（herps simplex virus, HSV）型胸苷激酶（thymidine kinase, tk）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。, CD/5-FC 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase, CD）

3、基因，在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（5-FU）。,1.自杀基因系统,旁观者效应:“自杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。,2. 旁观者效应,（五）基因免疫治疗,通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。,二、基因转移技术,The Technique of Gene Transfer,基因治疗的两种途径,载体,目的基因,in vivo,ex vivo,靶细胞,基因转移(gene transfer)技术：,1.病毒介导的基因转移系统。 2.非病毒介导的基因转移系统。,1.病毒介导的基因转移系统,病毒载体介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。,Retrovirus,（1）逆转录病毒,（1）两端各有一长末端重复序列LTR。,逆转录病毒前病毒的结构特点,（2）LTR由U3、R和U5三部分组成。,（3）病毒有三个结构基因,（4）5

4、端LTR下游有一段病毒包装所必需的序列（）,(1)在U3内有增强子和启动子； (2)U3和U5两端分别有病毒整合序列(IS) ； (3)在R内还有poly(A)加尾信号。,(1)gag基因，编码核心蛋白和属特异性抗原； (2)pol基因，编码逆转录酶； (3)env基因，编码病毒外壳或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。,逆转录病毒介导的基因转移系统 由两部分组成：,(1) 逆转录病毒载体,(2) 辅助细胞株(如PA317),Retroviral packaging system,逆转录病毒载体的特点,逆转录病毒包膜上由env编码的糖蛋白，能够被许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体识别，从而使逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。,逆转录病毒结构基因gag、env和pol的缺失不影响其他部分的活性。,前病毒可以高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。,包装好的假病毒颗粒（携带目的基因的重组逆转录病毒载体）以芽生的方式分泌至辅助细胞培养的上清液中，易于分离制备。,逆转录病毒载体的主要缺点,随机整合，有插入突变、激活癌基因的潜在危险； 逆转录病毒载体的容量较小，只

5、能容纳7 kb以下的外源基因。,（2）腺病毒(adenovirus，AV)载体 腺病毒是一种大分子(36 kb)双链无包膜DNA病毒。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，但目前尚未发现与肿瘤发生有关联。宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。,腺病毒的优点,1.基因导入效率高，对人类安全；,2.宿主范围广；,3.基因转导与细胞分裂无关；,4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；,5.腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因；,腺病毒载体缺点,2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。,3.有两个环节可能产生复制型腺病毒。,4.靶向性差。,1.不能整合到靶细胞的基因组DNA中。分裂增殖快的细胞，导入的重组病毒载体，随分裂而丢失的机会增多，表达时间相对较短。,(1)腺病毒产生过程中与293辅助细胞内E1区序列发生同源重组； (2)腺病毒载体与被治疗的患者体内已感染的野生型腺病毒，甚至乳头瘤病毒、巨细胞病毒发生重组。,（3）腺病毒相关病毒

6、载体 腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb，无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒（如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒）存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。,AAV载体是目前正在研究的一类新型安全载体，它对人类无致病性。 AAV可以高效定点整合至人19号染色体的特定区域19q13.4中，并能较稳定地存在。这种靶向定点整合可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达，并可受到周围基因的调控，兼具逆转录病毒载体和腺病毒载体两者的优点。,AAV载体的缺陷：,2.非病毒载体介导的基因转移系统 （1）脂质体介导的基因转移技术 脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。 基本原理:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。,脂质体介导的基因转移示意图,（2）受体介导转移技

7、术,将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。,受体介导转移技术示意图,（3）基因直接注射技术 不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。 动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。 将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%40%； 将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素； 肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需的凝血因子等等。,基因直接注射法的优点,制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易； 排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用； 导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点； 基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答

8、，致使反复治疗效果下降。,三、基因干预,Gene Interference,基因干预的种类：,1.反义RNA (antisense RNA) 2.干扰RNA (RNA interference) 3.核酶 (ribozyme),（一）反义RNA 1. 反义RNA与基因表达调控 利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种： （1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。 （2）构建能转录反义RNA的重组质粒，将质粒转入细胞，转录出反义RNA而发挥作用。,反义RNA的关键技术问题：,反义RNA进入靶细胞前的降解问题,专一性转移问题,2.受体介导反义RNA技转移术,受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高； 被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层, 可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。,将脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGP）与多聚赖氨酸（PL）共价连接，得到ASGP-PL复合物，成为运载核酸的工具。ASGP-PL反义RNA复合物可以专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别，并吞噬到肝细胞中，反义RNA进入肝细胞后，可被逐

9、渐释放出来发挥作用。,借助受体介导DNA转移方法把DNA换成反义RNA，就可以实现受体介导的反义RNA的转移。,3. 反义RNA的应用前景,受体介导的反义RNA基因治疗有其自身的优点，而在 一定程度上补充了转基因治疗的不足。,（l）安全性高,（2）反义RNA设计和制备方便,（3）具有剂量调节效应,（4）能直接作用于一些RNA病毒,反义RNA只作用于特异的mRNA分子，不改变所调节基因的结构。反义RNA分子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被降解，不留“残渣”。,在治疗RNA病毒感染性疾病时，受体介导的反义RNA基因治疗比一般的DNA基因治疗有更大的优势。利用反义RNA可以直接作用于病毒RNA，阻断RNA病毒的繁殖。,（二）干扰RNA,1.RNA干扰现象 RNA干扰（RNA interference， RNAi）是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。有义RNA（sense RNA）或反义RNA（antisense RNA）均能抑制线虫基因的表达，双链RNA比单链RNA更为有效。其抑制基因表达的效率比反义RNA至少高2个数量级。,2.RNA干扰的机制,RNA干扰过程主要有2个步骤：,（1）小干扰性RNA（siRNA）,（2）siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC)。,该复合体可识别与siRNA有同源序列的mRNA，并在特异的位点将该mRNA切断,长双链RNA被细胞内的双链RNA特异性核酸酶Dicer切成2123个碱基对的短双链RNA，称为小干扰性RNA（small interfering RNA，siRNA）,1） 体外化学合成;,2） 用质粒载体或病毒载体可在细胞内稳定地生成。,3.siRNA的产生,4.RNA干扰的应用前景 RNA干扰研究目前已经在功能基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等广泛领域取得了令人瞩目的进展，使其在医学、生物学领域的应用有着广阔的前景。,（1） 研究基因功能的新工具,由于 RNA干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力

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