实验一 质粒dna的提取和鉴定

1、质粒DNA的提取和纯化,生化与分子生物学系,分子生物学,从分子水平上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。,基因工程,移液器和EP管,质 粒,质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，独立于染色体之外的、能自主复制的双链环状脱氧核糖核酸物质。 质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒(抗药性因子)和Col质粒(产大肠杆菌素因子)等都是常见的天然质粒。 能稳定地独立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。 现在常用的质粒大多数是经过改造或人工构建的，常含抗生素抗性基因，是重组DNA技术中重要的工具。,分类： 单拷贝质粒； 多拷贝质粒； 紧密控制型； 松弛控制型；,质粒DNA的提取方法,碱裂解法； 煮沸裂解法； 酚氯仿抽提法；,概括起来主要是用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理。,基本思路,培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离质粒DNA

2、(有时还要求纯化质粒DNA，根据实验所需) 电泳检测；,碱裂解法的基本原理,十二烷基磺酸钠(SDS) 可使细胞膜裂解。 经SDS处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。 当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circularDNA，简称cccDNA)的两条链不会相互分开。 当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。,实验步骤,1、将含有质粒的DNA细菌在LB培养基中培养过夜。取1.5ml LB培养液倒入1.5mleppendorf管中，4下12000g离心30秒。 2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于100l溶液中（需剧烈振荡）。 4、加入新配制的溶液200l，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴2分钟。

3、5、加入150l预冷的溶液，盖紧管口，颠倒混匀，冰浴中5-10分钟，4下12000g离心5-10分钟。 6、上清液（450uL）移入干净eppendorf管中，加入等体积的饱和酚（1:1），充分颠倒混匀，4下12000g离心10分钟。,7、将水相（400uL）移入干净eppendorf管中，加入等体积酚/氯仿，颠倒混匀，12000rpm离心10min。 8、将水相（350uL）移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20冰箱中20分钟，然后4下12000g离心10分钟。 8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入0.5ml 70乙醇洗沉淀一次，4下12000g离心5-10分钟。 9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。 10、将沉淀溶于10l TE缓冲液（pH8.0，含20g/ml RNaseA）中，储于-20冰箱中。,LB液体培养基（Luria-Bertani）,称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7

4、.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。,溶液I,50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（pH8.0），10mmol/L EDTA（pH8.0）。溶液可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4冰箱,溶液I：重悬细菌； 葡萄糖：比重大，使细菌不易沉淀； TrisHCl：缓冲体系； EDTA：螯合金属离子；,溶液,0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1SDS,溶液II破膜，变性基因组DNA和蛋白质； SDS破膜作用，变性蛋白质； NaOH破膜，变性基因组DNA；,溶液,5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O 28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L，Ac5mol/L。,溶液III中和溶液，复性质粒DNA；,酚/氯仿（1:1）,酚变性蛋白质； 氯仿萃取溶液中的酚；,分为两层，上层为水层，下层为酚氯仿混合液。吸取时不要震荡。,乙醇,无水乙醇（2倍体积）沉淀质粒DNA； 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，除去沉淀中的盐分；,电 泳 Electrophoresis,

5、一、定义,电泳带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的现象。 电泳分析技术利用电泳现象进行物质分离的技术。,二、电泳分析技术发展概况,1809年 发现电泳现象 1937年 Tiselius 自由界面电泳 1948年 Wieland 滤纸电泳 1980年 毛细管电泳 (capiliary electrophoresis),三、电泳分析技术的分类,1.根据被分离样品的量多少 分析电泳 制备电泳 2.根据电泳电压的高低 常压电泳 0500 V 高压电泳 5003000V 3.根据电泳中是否使用支持物 自由电泳不使用支持物，在溶液中进行。 区带电泳使用支持物,4. 按支持物的物理性状不同,滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维 凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳 粉末电泳，纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳 丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳,5. 按支持物的装置形式不同 平板式电泳 垂直板式电泳 垂直柱式电泳,6.根据电泳系统pH是否连续 连续pH电泳指电泳过程中pH保持不变； 不连续pH电泳指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段也有不同的pH ；,电泳技术的

6、特点:,凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离,并可进行定性或定量分析; 样品用量极少; 设备简单; 可在常温进行; 操作简便省时; 分辨率高.,四、电泳的基本原理,一个分子，如能解离或能吸附带电质点，在电场中便会向正极或负极移动。,移动速度以蛋白质分子为例:,F= EQ （Q：有效电荷; E：电位梯度） F=6rv （F：摩擦阻力; v：在介质粘度中半径为r的颗粒的移动速度） F=F EQ=6rv,E Q v= 6r,迁移率（Mobility)带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。 V Q M = = E 6r,五、影响电泳速度的因素,1.电场强度（E） E电流热效应支持介质上的水分蒸发样品的热变性 E电泳速度慢延长电泳时间样品扩散区带模糊不清分辨率下降 2. 带点颗粒的半径 r 阻力电泳速度变慢 3. 支持物介质吸附作用；电渗作用；分子筛作用 缓冲液 离子强度（I）：I缓冲能力越大缓冲液所载的分电流增加，而样品所载的电流相应减少电泳速度减慢 pH：pH值决定了化合物解离的程度，也决定了质点所带的净电荷。,电泳,在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大

7、小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。 凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。,琼脂糖凝胶,从琼脂中除去带电荷的琼脂胶后，剩下的不含磺酸基团、羧酸基团等带电荷基团的中性部分，结构是链状的聚半乳糖，易溶于沸水，冷却后可依靠糖基间的氢键引力形成网状结构的凝胶。 凝胶的网孔大小和凝胶的机械强度取决于琼脂糖浓度。因此琼脂糖凝胶可作为分子筛，常用于凝胶层析和电泳。,电泳鉴定,其中超螺旋结构泳动最快； 其次为线性结构； 最慢的可能是复制中间体（没有复制完的两个质粒连在一起）；,染料EB,溴化乙锭（EB）是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，其分子可以嵌入到核酸的碱基对之间，在紫外线的激发下，发出橙色荧光。,注意,EB是诱变剂，配制和使用EB染色液时，应带乳胶手套或一次性手套，并且不要将该染色液洒在桌面或地面上，凡是沾污EB的器皿或物品，必须进行清洗或弃去。,细菌培养与质粒扩增,1. 挑单克隆E.coli菌株接种到斜面培养基上（活化菌种），37过夜培养 2. 从斜面培养基上挑E.coli菌株，接种于25毫升液体培养液内（含氨苄青霉素），37振荡过夜培养 3. 从中取4毫升种子菌液于含M9培养基中（含Ap），37振荡培养3-4小时（OD6001.0）,

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