实验一 质粒dna的提取
27页1、实验一 质粒DNA的提取,实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论,实验目的,了解碱法提取质粒的原理; 掌握碱法提取质粒的方法; 掌握DNA琼脂糖电泳的原理和方法。,实验原理,质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。,结构的三大要素: 多克隆位点 选择标记(耐药性,LacZ) 独立的复制单位 种类: 质粒 噬菌体 酵母人工染色体(YAC) 反转录病毒载体 表达载体等,pET-32a Vector,The pET System is the most powerful system yet developed for the cloning and expression of recombinant proteins in E. coli.,pET-32 cloning/expression region,Vector (pET-32a),Gene fragment (SmPR10),pET-32a
2、-SmPR10,质粒的分离是利用质粒DNA与染色体DNA在变性与复性中的差异来达到的目的。 当菌体在NaOH和SDS溶液(碱性条件pH 12.5)中裂解时,蛋白质与DNA发生变性,由于染色体DNA与质粒DNA拓朴构型不同,染色体DNA双螺旋结构解开,而共价闭环质粒DNA的氢键虽被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕仍会紧密地结合在一起。当加入乙酸钾溶液pH恢复至中性时, 在高盐浓度的情况下,染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构并与蛋白质-SDS复合物等形成沉淀;不同的是,质粒DNA复性迅速而准确,保持可溶状态而留在上清中。这样,通过离心可沉淀大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质。除去沉淀后上清中的质粒可用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤,可得到较纯的质粒DNA。,实验仪器、材料与试剂,(一) 仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器,(二) 材料,大肠杆菌E. coli DH 5含重组质粒 pET-32a-SmPR10,(三) 试剂,1. LB液体培养基(1L) 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g N
3、aCl 10 g 加去离子水至800ml,搅拌,使溶质完全溶解,用NaOH调节pH值至7.0,加入去离子水至总体积为1升,高压蒸汽灭菌20 分钟。 LB固体培养基(1L) 在上述LB液体培养基(1L)中加入琼脂粉15g。,2. 溶液:葡萄糖(50mmol/L );TrisHCl( 25mmol/L, pH8.0); EDTA (10mmol/L) 3. 溶液: NaOH (0.2mol/L) ;SDS ( 1%,新鲜配制) 4. 溶液: 60ml的 5mol/L KAC ; 11.5ml的冰醋酸 ; 28.5ml H2O,溶液I:低浓度的葡萄糖溶液使细胞处于低渗状态而细胞澎胀;葡萄糖的作用是增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械剪切作用,防止破坏DNA。 EDTA的作用是螯和掉Mg2+、Ca2+等二价金属离子,防止DNA酶对质粒分子的降解作用。 TrisCl能使溶菌液维持溶菌作用的最适PH范围。,溶液II:SDS的作用:破坏细胞膜;解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。 NaOH(pH12)的作用:破坏氢键,使DNA分子变性。,溶液III:由KAc与HAc组成,是pH值为5.5的高盐溶液
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