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革兰氏染色法与芽孢染色法

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常见问题

1、实验二革兰氏染色法与芽孢染色法,（一）目的,了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性学习掌握革兰氏染色技术，巩固学习光学显微镜油镜的使用方法,一、革兰氏染色法,（二）原理,革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。当用结晶紫初染后，所有细菌都被染成初染剂的紫色。碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低，用乙醇脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。,（三）材料,菌种大肠杆菌，金黄色葡萄球菌染色剂结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸复红液。

2、仪器或其他显微镜、擦镜纸、接种环、载玻片、酒精灯、蒸馏水、香柏油、二甲苯。,（四）实验步骤,镜检,制片（涂片干燥固定）,染色（初染媒染脱色复染）,初染,滴加结晶紫(以刚好将菌膜覆盖为宜)于玻片的涂面上，染色12min ，倾去染色液，细水冲洗至洗出液为无色，将载玻片上水甩净。,脱色,用卢戈氏碘液媒染约l min ，水洗。,媒染,用吸水纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，用滴管流加95%的乙醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时（2030），立即水洗，终止脱色，将载玻片上水甩净。,复染,在涂片上滴加番红液复染约3min ，水洗，然后用吸水纸吸干。,乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节。脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌；脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。,镜检,干燥后，用油镜观察。菌体被染成紫色的是革兰氏阳性菌（G+）；菌体被染成红色的为革兰氏阴性菌（G-）。,Gram Stain of Staphylococcus aureus,Gram Stain of Escherichia coli,A Gram Stain of a Mixture of Gram-Positive and Gram-

3、Negative Bacteria.,枯草芽孢杆菌,乳酸杆菌,注意事项 1. 取菌时要严格无菌操作，接种环每取一次菌种后，都要及时灭菌。 2.细菌涂片要薄，镜检以分散开的细菌的颜色为准，过于密集常常呈假阳性。 3.严格控制染色和脱色时间,（五）实验结果,记录两种细菌（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌）观察结果，绘出两种细菌油镜下的染色视野图。注明物镜放大倍数及总放大倍数。,二、细菌芽孢染色法,（一)目的,学习并掌握芽孢染色法。,(二)原理,芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难。因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢。进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出。若再用复染液（如番红液）处理，则菌体和芽孢易于区分。,(三)材料,菌种：枯草芽孢杆菌染色剂：孔雀绿染液，番红染液。,(四)操作步骤,（1）将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。（2）将固定好的涂片装入装片架，置于染色缸中的孔雀绿染液中。（3）加热染液,近沸腾时开始计时约1015分钟。（4）取出涂片，待冷却后，水洗，至孔雀绿不再褪色为止。（5）用番红染液复染1分钟，水洗。（6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。,芽孢染色法染色结果：位于红色细胞内绿色的为芽胞,注意：在孔雀绿染色液加热染色时，电热炉应放地上，而不要放到桌面上加热，加热时注意安全。在孔雀绿染色液加热染色结束后，关闭电炉，注意不要在高温时徒手拿下染色缸，以免烫伤及浪费染液。取出玻片后，要待冷却才能用水冲洗。,(五)实验报告,绘制油镜下观察到的结果（表示出观察到的芽孢杆菌的芽孢形状、大小及着生位置）,（六）思考题你认为哪些环节会影响革兰氏染色和芽孢染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？,1、实验结束注意物品归位。包括显微镜、使用药品、试剂等。拨下显微镜电源插头,将线绕在镜架上，记录本放于载物台上 2、实验凳子放于台下靠里,养成良好的实验习惯，将使你终生受益！,破伤风梭菌,枯草芽孢杆菌,芽孢,涂片,

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