酶动力学分析

1、,酶动力学分析,酶促反应动力学,学习目的： 1、了解酶促反应特点及与一般化学反应的区别。 2、掌握0、1级和米氏酶促反应动力学及应用原理； 3、了解存在抑制时的酶促反应动力学特征； 4、具备固定化酶反应中的过程分析能力和内外不同阶段的固定化酶动力学的应用能力； 5、熟悉酶的失活动力学与反应过程中酶失活动力学行为。,酶促反应动力学,第一节 均相酶促反应动力学 第二节 固定化酶促反应动力学 第三节 酶的失活动力学,酶促反应（Enzymatic reaction）：,研究酶促反应,研究生物反应的基础,酶促反应动力学,酶催化反应机制,对酶促反应速率的规律进行定性或定量的描述,建立反应动力学方程,确定适宜的操作条件,酶促反应特征,优点： 反应在常温、常压、中性pH范围进行，节能且效率高。 反应专一性强，副产物生成少； 反应体系简单，反应最适条件易于控制。,不足： 反应仅限少数步骤，经济性差； 反应周期较长；,第一节 均相酶促反应动力学,一、酶促反应动力学基础 二、单底物酶促反应动力学 1、米氏方程 2、操作参数对酶促反应的影响 3、抑制剂对酶促反应速率的影响 三、多底物酶促反应动力学,均相酶催化

2、反应: 指酶与反应物系同处液相的酶催化反应. 因此不存在相间的物质传递. 均相酶催化反应动力学所描述的反应速率与反应物系的基本关系,反映了该反应过程的本征动力学关系,而且酶与反应物的反应是分子水平上的反应.,一、酶促反应动力学基础 影响酶促反应的因素：,浓度：,酶浓度,底物浓度,外部因素（环境因素）：,溶液的介电常数与离子强度,压力,温度,pH值,内部因素（结构因素）：,底物浓度及效应物,酶结构,产物浓度,零级反应 酶促反应速率与底物浓度无关。,式中：S底物浓度； rmax最大反应速率。,（3-1）,一级反应 酶促反应速率与底物浓度的一次方成正比。 酶催化AB的反应,式中： 一级反应速率常数； 底物A的初始浓度； bt时产物B的浓度。,（3-2）,二级反应 酶催化A+BC的反应,式中： 二级反应速率常数； 底物A和底物B的初始浓度； ct时产物C的浓度。 积分上式，得：,（3-3）,（3-4）,连锁反应 酶催化A B C的反应,式中： A，B，C的浓度； 各步反应的速率常数；,（3-5）,（3-6）,（3-7）,如果A的初始浓度为a0， B和C的初始浓度为0， 并且a+b+c=a0，则

3、可求得：,（3-8）,（3-9）,（3-10）,二、单底物酶促反应动力学,单底物酶促反应指一种反应物（底物）参与的不可逆反应。如：水解酶、异构酶和多数裂解酶催化的反应。 1、米氏方程 Henri中间复合物学说 Michaelis-Menten方程 Briggs-Haldane方程 动力学特征（米氏方程的讨论） 动力学参数的求取, Henri中间复合物学说：,式中： efree游离酶； CS底物浓度； CES 酶-底物复合物浓度； CP产物浓度； K+1酶与底物形成复合物的反应速度常数； K-1复合物解离为酶和底物的反应速度常数； K+2ES复合物分解生成产物的反应速度常数。,反应速率：单位时间、单位反应体系中某一组分的变化量来表示。对均相酶催化反应，单位反应体系常用单位体积表示。反应速率为：,式中：rs 底物S的消耗速率，mol/(L.s); rP产物P的生成速率， mol/(L.s); V反应体系的体积，L； CS底物S的物质的量，mol； CP产物P的物质的量，mol； t时间，s；,根据质量作用定律，P的生成速率可表示为：,( 3-11 ),式中： CES 中间复合物ES的浓度，

4、它为一难测定的未知量，因而不能用它来表示最终的速率方程。,对上述反应机理，推导动力学方程时的三点假设：,（1）在反应过程中，酶的浓度保持恒定，即：CE0=CE+CES。 （2）与底物浓度CS相比，酶的浓度是很小的，因而可以忽略由于生成中间复合物ES而消耗的底物。 （3）产物的浓度是很低的，因而产物的抑制作用可以忽略，也不必考虑P+EES这个逆反应的存在。 据此假设所确定的方程仅适用于反应初始状态。,Michaelis-Menten方程推导过程：,“快速平衡学说”（rapid equilirium）: 假设：酶与底物反应生成复合物,和复合物又解离成酶和底物的反应之间快速建立平衡,而复合物解离成产物和酶,即ESE+P是整个反应的限速步骤，即由酶和底物反应生成中间复合物的可逆反应在初速度测定时间内已经达到平衡。,根据上述假设和式（3-11），有:,和,或表示为：,式中：CE游离酶的浓度，mol/L； CS底物的浓度，mol/L; KS解离常数， mol/L;,反应体系中酶的总浓度CE0为：,所以：,即：,( 3-12 ),式中： r P,max产物的最大生成速率，mol/(L . s); C

5、E0酶的总浓度，亦为酶的初始浓度，mol/L;,式（3-12）即米氏方程，式中的两个动力学参数是KS和rP,max。其中：,KS表示了酶与底物相互作用的特性。KS的单位和CS的单位相同，当rP=1/2 rP,max 时，存在KS=CS关系。 rP,max =k+2CE0。表示当全部酶都呈复合物状态时的反应速率。 k+2又叫酶的转换数。表示单位时间内一个酶分子所能催化底物发生反应的分子数，因次，它表示酶催化反应能力的大小，不同的酶反应其值不同。 rP,max正比于酶的初始浓度CE0。实际应用中将k+2和CE0合并应用为一个参数。, Briggs-Haldane方程,1925年，Briggs和Haldane对米氏方程的推导作了一项很重要的修正。他们认为，当k+2k-1时米氏假设中的快速平衡（ripid equilibrium）不一定能够成立，所以，不能用上述“平衡学说”推导。即当从中间复合物生成产物的速率与其分解成酶和底物的速率相差不大时，米氏方程的平衡假设不适用。他们提出了“拟稳态”假设，认为由于反应体系中底物浓度要比酶的浓度高的多，中间复合物分解时所产生的酶又立即与底物相结合，从而使反

6、应体系中复合物浓度维持不变，即中间复合物的浓度不随时间而变化。,根据反应机理和上述假设，有下述方程式：,又因为有：,所以：,式中：Km米氏常数，mol/L; Km与Ks的关系为：,( 3-13),( 3-14 ),当k+2k-1时，Km=Ks，即生成产物的速率大大慢于酶底物复合物解离的速率。 Km值的大小与酶、反应物系的特性以及反应条件有关。,某些酶促反应的Km值：P30表3-1,M-M方程与B-H方程比较见下表,在M-M方程和B-H方程的推导中都假设CE0CS0，因而CES值也很小。如果酶的浓度很高， CES值在反应过程中有可能是很高的。若仍然采用上述方程会带来较大误差。此时物料平衡和速率方程可表示为：,动力学特征（米氏方程的讨论）,根据米氏方程，酶反应的速度与底物浓度的关系为一双曲线，P30图3-1。该曲线表示了三个不同动力学特点的区域。,当CSKm，即底物浓度比Km值小很多时，该曲线近似为一直线。表示反应速率与底物浓度近似成正比关系，此时酶催化反应成为一级反应速率方程。,当Km值很大时，大部分酶为游离态的酶，而CES的量很少。要想提高反应速率，只有通过提高CS值，进而提高CES，

7、才能使反应速率加快。因而此时反应速率主要取决于底物浓度的变化。 将上式进行重排，积分，可以推出,( 3-15 ),式中：CS0底物的初始浓度，mol/L; 这个原理在酶法分析中被应用。利用酶测定底物时，可使用足够量的酶以便在较短时间内，使反应达到完全。这样测定形成的产物总量就与待测物的量相等或相关。,当CSKm时，该曲线近似为一水平线，表示当底物浓度继续增加时，反应速率变化不大。此时酶反应可视为零级反应，反应速率将不随底物浓度的变化而变化。这是因为当Km值很小时，绝大多数酶呈复合物状态，反应体系内游离的酶很少，因而即使提高底物的浓度，也不能提高其反应速率。,( 3-16),即：,或：,当CS与Km的数量关系处于上述两者之间的范围时，即符合米氏方程所表示的关系式。在t=0时，CS=CS0，对（2-13）式积分得到：,或：,式中：,，XS为底物转化率。,Levenspiel提出亦可用幂函数形式表示米氏方程，为：,总结： M-M方程平衡假设：,B-H方程拟稳态假设：,动力学参数的求取,将米氏方程线性化，用作图法求取动力学参数rmax（或k+2）和Km值。 A、Lineweaker-Burk法

8、（L-B法） B、Hanes-Woolf法（H-W法） C、Eadie-Hofstee法（E-H法） D、积分法,A、Lineweaker-Burk法（L-B法）,将米氏方程取倒数，得到：,以1/rs对1/CS作图得一直线，斜率为Km/rmax，直线与纵轴交于1/rmax，与横轴交于-1/Km。此法称双倒数图解法。见图2-2（a）。,B、Hanes-Woolf法（H-W法）,上式两边均乘以CS，得到：,以CS/rS对CS作图，得一直线，斜率为1/rmax，直线与纵轴交点为Km/rmax，与横轴交点为-Km。 见图2-2（b）。,C、Eadie-Hofstee法（E-H法）,将米氏方程重排为：,以rS对rS/CS作图，得一直线，斜率为-Km，与纵轴交点为rmax，与横轴交点为rmax/Km。见图2-2（c）,D、积分法,将动力学实验中测得的时间与浓度数据直接代入米氏方程的积分形式，经整理得到：,与,对应作图，得到图2-2（d）,应用直线作图法求取动力学参数：,练习： P31例3-3葡萄糖在葡萄糖异构酶存在时转化为果糖的反应是可逆反应，在平衡状态下，底物和产物都有相当的量，必须考虑逆反应。

9、 请参见解题和生物反应器工程P11，三、可逆反应，双底物反应和辅因子活化动力学。,2、操作参数对酶促反应的影响,在诸多影响酶催化活性的因素中，比较重要的有pH值、温度、流体力、化学试剂和辐射（声、光等）。其中最常遇到，影响最大的是pH值和温度的作用。 pH值的影响 温度的影响,pH值的影响,构成酶蛋白的氨基酸含有碱性、中性和酸性基团。在一定的pH值下，酶具有带正电荷基团也带有负电荷基团，而这些基团常是构成活性点的部分。一种酶往往只是在一种特定的电荷状态下才具有催化活性。随着pH值的变化，具有这种特定电荷状态的酶只占有总酶的或多或少的一部分，酶的相对活力有一个最大值，即相对活力-pH曲线常呈钟罩形，见图。,根据以上分析，Michaelis对pH值与酶活力的关系提出三状态模型的假设，基本点如下： 1、假定酶分子有两个可解离的基团，随着pH值的变化，分别呈现出EH2、EH-及E2-三种状态，即：,EH2 EH- E2-,酸性条件下，酶呈EH2状态；当pH增加，酶以EH-状态存在；当pH继续增加，酶以E2-状态存在。 2、上述三种解离状态中，只有EH-型具有催化活性。 3、底物S的解离状态不变。 4、速率控制步骤为由EHS-生成产物P的速率。,反应机理式可表示为：,根据酶催化反应动力学的一般原理，可有下述的基本关系式：,( 3-29 ),( 3-30 ),( 3-31 ),若定义： 经整理可得到下式： 式中：Ka、Ka,、Kb、Kb,电离平衡常数，氢离子浓度。 CH+氢离子浓度。,( 3-3235 ),( 3-36 ),由上式可以看出，f1和f2均与pH值有关。P21图2-3表示了pH值的变化对反应速率相对值的影响。从该图可以看出，对酶催化反应适宜的pH值约处于69之间。,图3-3,温度的影响,温度对酶催化反应的影响是，在较低的温度范围内，反应速率随着温度的升高而加快，超过某一温度，即酶被加热到生理允许温度以上，酶的反应速率反而随着温度的上升而下降。这是因为温度升高，虽然可加速酶

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