相对定量实验方法与数据分析
22页1、相对定量实验方法与数据分析相对定量实验方法与数据分析 -CT法为例 林天时 柏业贸易(上海)有限公司 021-5080-1191/0969-802021-5080-1191/0969-802 内容内容 1.相对定量实验所需材料 2.荧光定量PCR的实验过程 2.1.引物/探针设计 2.2.核酸制备 2.3.试剂配制 2.4.PCR循环设计 2.5.样品孔设计 3.数据分析 1.相对定量实验所需材料1.相对定量实验所需材料 ?总RNA提取试剂 ?cDNA合成试剂盒 ?SYBRGreen Real-Time PCR Premix Kit(染料法)或 TaqMan Real-Time PCR Premix Kit (探针法) ?用于相对定量实验的引物/探针(可选,用于TaqMan体系) ?应用于荧光定量PCR实验的8联排管或96/384孔板和应用于荧光定量PCR实验的8联排管 盖或光学封口模(根据厂家的仪器不同,相应配套耗材也不同) ?荧光定量PCR仪 ?离心机和离心管 ?DEPC water和PCR water ?移液枪、枪头、无菌手套 ?振荡混匀仪 2.相对定量的实验过程2.相对定量的
2、实验过程 设计:设计:1. 相对定量实验的引物及探针设计、合成 2. 确定相对定量PCR实验应用的试剂 3. PCR循环设计 操作:操作:1. 相对定量实验样本的制备(RNA和DNA) 2. 试剂混合 3. 仪器软件设置和运行 数据分析数据分析 相对定量的数学方法 Ct法基于相同条件下,目的基因的扩增效率与内参 基因的扩增效率相同的假设,所以引物设计就成为实验的关键 2.1.应用于相对定量实验的引物和探针设计2.1.应用于相对定量实验的引物和探针设计 如果使用TaqMan探针,那么TaqMan探针的结合位置应尽量靠近引物的结合位置, 最好仅相差一个碱基。TaqMan探针的分析方法依赖于Taq酶的5-3外切酶活性。 引物设计要点引物设计要点 ?引物长度和序列:引物长度一般为18-30base之间,在紧靠引物3端的5个碱基中不能出现2个或2 个以上的G或C序列,这样会增加非特异性扩增的可能性。上下游引物避免出现连续的互补序列,防 止引物二聚体的形成 ?扩增产物长度:扩增产物长度最好控制在50-150bp之间,因为扩增较小的片断,PCR效率高。如果 扩增产品不能减少到150bp以内,但可以保
3、证PCR效率接近100%的引物也可以使用。 ?G/C含量:G/C含量可以在30% 80%之间,不要出现连续4个相连的G. 如果引物序列中的G/C含量 过高会降低PCR效率,也可能会增加非特异性扩增的可能性。在使用SYBRGreen法的相对定量实验时 更应注意引物序列中的G/C含量 ?Tm值:引物的Tm值是关系到PCR循环设计的参数,引物的Tm一般设计在5860,上下游引物的Tm 不要相差2 以上。探针的Tm值高于引物的Tm值5 10 左右 ?探针序列:在探针的5端结尾碱基不能是G,因为如果G存在,探针即使在水解后的荧光也依然会 被粹灭,影响结果分析 备注:如果您的设计经验不足,BIONEER可以提供TaqMan的设计合成服务备注:如果您的设计经验不足,BIONEER可以提供TaqMan的设计合成服务 2.2. 相对定量的样本制备2.2. 相对定量的样本制备 ? RNA制备:提取总RNA,用于相对定量的RNA的纯度要达到A260/A2801.8。对 于从特殊样本中提取的总RNA要保证提取后的RNA中不含PCR酶抑制剂。 ? cDNA合成:使用逆转录酶或逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA
4、,生成的cDNA可 以直接用于扩增. 合成的cDNA为避免反复冻融,合成后应立即分装以供多次 使用。 RNA制备和cDNA合成过程的注意事项:RNA制备和cDNA合成过程的注意事项: 1. RT实验用的器材(包括1ml、200l、20l Tip头;EP管和PCR反应管等): 用0.1%的DEPC水(1000 ml超纯水加1ml DEPC)37浸泡过夜,高压灭菌 。 2. 提取的RNA溶解和cDNA合成均要使用DEPC水 3. 合成cDNA时,RNA的用量和cDNA的产量与厂家提供的试剂盒有关,请参照试剂 生产厂家的说明书操作 2.3. 试剂选择2.3. 试剂选择 有两类预混合试剂盒可供选择:有两类预混合试剂盒可供选择: ?SYBR Green Real-Time PCR PreMix:SYBR Green Real-Time PCR PreMix: 应用于基于SYBR Green方法的相对定量分析。要配合使用熔 解曲线软件分析,确定是否存在引物二聚体和非特异性扩增。如果引物设计合理,无引物二聚体和 非特异性扩增产生,那么使用SYBR Green是经济实用的最佳选择 ?TaqMan Re
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