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相对定量实验方法与数据分析

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  • 卖家[上传人]:suns****4568
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  • 上传时间:2019-05-22
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    • 1、相对定量实验方法与数据分析相对定量实验方法与数据分析 -CT法为例 林天时 柏业贸易(上海)有限公司 021-5080-1191/0969-802021-5080-1191/0969-802 内容内容 1.相对定量实验所需材料 2.荧光定量PCR的实验过程 2.1.引物/探针设计 2.2.核酸制备 2.3.试剂配制 2.4.PCR循环设计 2.5.样品孔设计 3.数据分析 1.相对定量实验所需材料1.相对定量实验所需材料 ?总RNA提取试剂 ?cDNA合成试剂盒 ?SYBRGreen Real-Time PCR Premix Kit(染料法)或 TaqMan Real-Time PCR Premix Kit (探针法) ?用于相对定量实验的引物/探针(可选,用于TaqMan体系) ?应用于荧光定量PCR实验的8联排管或96/384孔板和应用于荧光定量PCR实验的8联排管 盖或光学封口模(根据厂家的仪器不同,相应配套耗材也不同) ?荧光定量PCR仪 ?离心机和离心管 ?DEPC water和PCR water ?移液枪、枪头、无菌手套 ?振荡混匀仪 2.相对定量的实验过程2.相对定量的

      2、实验过程 设计:设计:1. 相对定量实验的引物及探针设计、合成 2. 确定相对定量PCR实验应用的试剂 3. PCR循环设计 操作:操作:1. 相对定量实验样本的制备(RNA和DNA) 2. 试剂混合 3. 仪器软件设置和运行 数据分析数据分析 相对定量的数学方法 Ct法基于相同条件下,目的基因的扩增效率与内参 基因的扩增效率相同的假设,所以引物设计就成为实验的关键 2.1.应用于相对定量实验的引物和探针设计2.1.应用于相对定量实验的引物和探针设计 如果使用TaqMan探针,那么TaqMan探针的结合位置应尽量靠近引物的结合位置, 最好仅相差一个碱基。TaqMan探针的分析方法依赖于Taq酶的5-3外切酶活性。 引物设计要点引物设计要点 ?引物长度和序列:引物长度一般为18-30base之间,在紧靠引物3端的5个碱基中不能出现2个或2 个以上的G或C序列,这样会增加非特异性扩增的可能性。上下游引物避免出现连续的互补序列,防 止引物二聚体的形成 ?扩增产物长度:扩增产物长度最好控制在50-150bp之间,因为扩增较小的片断,PCR效率高。如果 扩增产品不能减少到150bp以内,但可以保

      3、证PCR效率接近100%的引物也可以使用。 ?G/C含量:G/C含量可以在30% 80%之间,不要出现连续4个相连的G. 如果引物序列中的G/C含量 过高会降低PCR效率,也可能会增加非特异性扩增的可能性。在使用SYBRGreen法的相对定量实验时 更应注意引物序列中的G/C含量 ?Tm值:引物的Tm值是关系到PCR循环设计的参数,引物的Tm一般设计在5860,上下游引物的Tm 不要相差2 以上。探针的Tm值高于引物的Tm值5 10 左右 ?探针序列:在探针的5端结尾碱基不能是G,因为如果G存在,探针即使在水解后的荧光也依然会 被粹灭,影响结果分析 备注:如果您的设计经验不足,BIONEER可以提供TaqMan的设计合成服务备注:如果您的设计经验不足,BIONEER可以提供TaqMan的设计合成服务 2.2. 相对定量的样本制备2.2. 相对定量的样本制备 ? RNA制备:提取总RNA,用于相对定量的RNA的纯度要达到A260/A2801.8。对 于从特殊样本中提取的总RNA要保证提取后的RNA中不含PCR酶抑制剂。 ? cDNA合成:使用逆转录酶或逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA

      4、,生成的cDNA可 以直接用于扩增. 合成的cDNA为避免反复冻融,合成后应立即分装以供多次 使用。 RNA制备和cDNA合成过程的注意事项:RNA制备和cDNA合成过程的注意事项: 1. RT实验用的器材(包括1ml、200l、20l Tip头;EP管和PCR反应管等): 用0.1%的DEPC水(1000 ml超纯水加1ml DEPC)37浸泡过夜,高压灭菌 。 2. 提取的RNA溶解和cDNA合成均要使用DEPC水 3. 合成cDNA时,RNA的用量和cDNA的产量与厂家提供的试剂盒有关,请参照试剂 生产厂家的说明书操作 2.3. 试剂选择2.3. 试剂选择 有两类预混合试剂盒可供选择:有两类预混合试剂盒可供选择: ?SYBR Green Real-Time PCR PreMix:SYBR Green Real-Time PCR PreMix: 应用于基于SYBR Green方法的相对定量分析。要配合使用熔 解曲线软件分析,确定是否存在引物二聚体和非特异性扩增。如果引物设计合理,无引物二聚体和 非特异性扩增产生,那么使用SYBR Green是经济实用的最佳选择 ?TaqMan Re

      5、al-Time PCR PreMix;TaqMan Real-Time PCR PreMix;应用于基于TaqMan技术的相对定量分析,结果无需使用熔解曲线 分析。如果无法解决引物二聚体和非特异性扩增的问题,那么可以使用TaqMan探针来代替SYBR Gre en法,因为在TaqMan探针的定量PCR体系中,引物二聚体和非特异扩增不会产生荧光信号,所以即 使存在引物二聚体或非特异性扩增也不会影响结果分析 ?BIONEER相关产品:BIONEER相关产品:GreenStar Real-Time PCR Premix(SYBRGreen), Dual-Star Real-Time PCR Pr emix(TaqMan探针),独特的冻干粉状Real-Time PCR Premix,有效避免分装时的加样误差。 -20条件下可达到12个月的保存期,远远超过液态Real-Time PCR Premix 3个月的有效期。 自制荧光定量PCR试剂体系:自制荧光定量PCR试剂体系: ?常规PCR体系 ?SYBRGreen或TaqMan探针 备注:备注:Real-Time实验中通常使用热启动酶以降低引物二

      6、聚体和非特异性扩增出现的可能性, SYB RGreen对PCR反应有抑制作用,加入量要进行优化 混合试剂混合试剂 混合混合: 试剂按照体积大小从大往小的加,将引物/探针(TaqMan方法选用),Real-Time PCR Premix 和PCR water加入到反应管中,cDNA模板最后加。如果是同种引物/探针有多管 的话只是DNA不同,那么采取的方法是算出总体积后加在一个管子里面,混合均匀之后 再分装到各个管子里去,这样可以有效地避免误差及污染 操作注意事项操作注意事项 1. 样本制备区和加样区要同扩增区分开,避免污染。定量PCR是非常灵敏的实验,微量污 染也会被扩增出,影响结果分析 2. 加样操作要做到非常精确,微量的加样误差也会对实验的重复性造成非常大的影响 3. PCR预混合液如果需要多次使用,要避光分装保存。避免反复冻融和荧光染料见光降解 4. 每次使用PCR预混合液时要等融化后完全混匀,否则对PCR效率造成很大影响 试剂50L体系20L体系终浓度 Forward Primer1-2l1-2l0.3M-1.0M Reverse Primer1-2l1-2l0.3M-1.0M

      7、cDNA模板5-10l2-4l500ng DEPC water适量适量 总体积50L20L 备注:备注: 1. 大多数情况下,引物终浓度在0.5M是合适浓度。如果扩增效率不高,可提高引 物的浓度。如果发生非特异性扩增反应时,应降低引物浓度。引物种浓度请在 0.3M-1.0M进行优化 2. 初次实验时,最好将DNA模板进行梯度稀释,以内参基因的Ct值在15-25之间为 合适的浓度。 3. 定量PCR反应体系的配备与各试剂厂家提供的试剂而不同,使用其他厂家的试剂 时,请参照相关厂家的操作说明书配置 典型的PCR反应体系典型的PCR反应体系 ? 以BIONEER GreenStar qPCR PreMix为例 步骤温度时间 预变性951-10min 循环中的变性9520s 退火50-6030s 延伸68-7230s 两步法PCR循环设计两步法PCR循环设计 步骤温度时间 预变性951-10min 循环中的变性9520s 退火/延伸6030s 备注:备注: 1. 变性时间长短由DNA来源和GC含量决定,退火的温度由引物的Tm值决定, 一般设为低于引物Tm值5 。延伸的时间由扩增产物的片断大小所

      8、决 定。PCR循环中各步条件都可以通过优化达到最佳。 2. 如果扩增产物片断长度在300bp以内。也可以采用二步法PCR进行实验, 即退火和延伸合为一步,温度可在60 -65 之间选择 2.4. PCR循环设计2.4. PCR循环设计 三步法PCR循环设计三步法PCR循环设计 2.5. 反应板设计2.5. 反应板设计 设置样品孔时的关键要素(以BIONEER Exicyler 荧光定量PCR仪为例):设置样品孔时的关键要素(以BIONEER Exicyler 荧光定量PCR仪为例): ?探针(Probe) :探针(Probe) : 用来检测目的基因和内参基因的报告基团。 ?未知样品(Unknown Sample):未知样品(Unknown Sample): 要进行定量的未知目的基因样品和内参基因样品 ?阳性对照(Positive Control)阳性对照(Positive Control):无需设置专门的阳性对照,以内参基因代替 ?无模板对照(NTC):无模板对照(NTC):具备其他所有试剂,为加入DNA模板 ?样品名称(Sample Name): 样品名称(Sample Name):

      9、 定义样品的不同来源 设置样品孔时的注意事项:设置样品孔时的注意事项: ?要分别设置为不同的探针名称和不同探针颜色进行区分 ?设置无模板对照监控污染 ?同一样品至少做2个复孔以获得一致的重复性结果,相对应的内参基因样品也要做 同样数量的重复孔 ?在软件设置中,所有的样品孔设置“Unknown Sample” ,无模板对照设置为“NTC” 备注:备注:样品孔和对照孔的信息设置一定要正确设置,符合CT分析方法的格式。 否则会导致实验结果不能用相对定量的软件进行自动分析 Sample NameProbe Name 应用举例:反应板设置样板应用举例:反应板设置样板 样品孔信息样品孔信息 3.数据分析数据分析 双击鼠标打开“Exicycler Analysis” 程序 在弹出的对话框中选择“Relative Quantification”,选择 “Ok” 扩增效率分析:通过观察荧光曲线是否是典型的“S”型曲线,可以判断扩增效率扩增效率分析:通过观察荧光曲线是否是典型的“S”型曲线,可以判断扩增效率 Flu.Graph中分析原始荧光曲线Flu.Graph中分析原始荧光曲线 ?大部分情况下,可以使用自动生成的域值进行数据分析 在“probe”匡中选择 一种探针,然后将 “Threshod”和 “baseline”匡中的 “auto” 改 为”manual”, 调整基 线的起点和终点 基线起点:基线起点:进口试 剂起点设为3,国产 试剂起点设为6 基线终点:基线终点:如果最小的Ct值大于 18,那么终点设为15。如果大于 18,基线终点设为Ct3 如果数据质量不佳,如曲线形状不正常或重复性不佳,可以尝试进行基线调整,重 新生成域值进行数据分析 Flu.Graph在中调整基线Flu.Graph在中调整基线 在Report Form中分析数据质量在Report Form中分析数据质量 重复性分析重复性分析 重复样本Ct值差异0.5,数据为有效数据 如果Ct值差异0.5,删除变异大的数据重 新分析 选择参照:选择参照:选择 某种样本作为参 照样本进行分 析,被选择的样 本相对表达量为1 在R

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