高盐法提取dna操作
2页1、高盐法提取DNA操作一 所需试剂1 TNES抽提缓冲液:10 mM Tris-HCl; 400mM NaCl;100 mM EDTA;0.6 % SDS;10M NaOH调节pH =7.5,高压灭菌; 2 TE 缓冲液:10mmol/LTris-HCl;1mmol/L EDTA;(浓)盐酸调节pH=8.0,加ddH2O定容至50ml,高压灭菌;3 蛋白酶K (1mg/ml或20mg/ml),颠倒混匀;4饱和NaCl;(5 M NaCl也可),高压灭菌;5 无水乙醇或异丙醇(-20预冷)6 70乙醇7 ddH2O二 操作步骤1 准备小镊子、小剪刀、PE手套、卷筒纸、marker笔、写好标记的EP管及EP管插板、1000l、100l、10l移液枪及大口径枪头,开水浴锅到55;2 若为冷冻肌肉样品,则预先在EP管中加入400l TNES缓冲液,再剪取30-50mg鱼类背部肌肉,在PE手套上用小剪刀尽量剪碎,放入EP管中; 若为酒精浸泡肌肉样品,则取酒精浸泡的鱼类背部肌肉约30-50mg,尽量剪碎,放入EP管中,置于烘箱中烘干(或室温放置半小时)至无酒精味,再加入400l TNES缓冲液;3
2、取出冷冻保存的蛋白酶K,待其稍解冻,每个EP管加入1l 20mg/ml蛋白酶K(或加入20l 1mg/ml 蛋白酶K),将EP管插浮板上,55水浴5-6h;注:水浴的过程中,开始每隔30min用小枪头轻轻搅动EP管中的肌肉8-10下,稍混匀,共搅动3次。注意动作要轻。4 水浴结束后将EP管取出,(放冰箱)冷至室温,加入120l饱和NaCl(或5M NaCl)和120l氯仿; 5 将EP管放摇床上颠倒混匀5-10min,4,13000rpm离心25-30min;6 取出EP管,用大口径枪头吸取上清(400-450l),加入2倍体积冷冻无水乙醇或异丙醇(约900l),轻轻颠倒混匀5-6次;7 将EP管插在浮板上放-20沉淀DNA 1h-1.5h;8 常温,13000rpm离心20min沉淀收紧DNA;9 离心完毕可见EP管底部有小块白色或稍透明的白色沉淀,加入800l 70%乙醇,摇床上颠倒混匀5min,13000rpm离心5min,弃上清(注意不要倒掉DNA沉淀);10 加入500l 70%乙醇,摇床上颠倒混匀5min,13000rpm离心2-5min,弃上清(可用枪头吸尽残液,注意不要吸到DNA沉淀);11 打开EP管管盖插浮板上,放37恒温箱中或室温晾干约半小时,去除残余乙醇;12 在EP管中加入50-100l灭菌dd H2O或TE缓冲液,可轻轻吹打使DNA沉淀悬浮在灭菌dd H2O或TE缓冲液中,放4待DNA沉淀溶解,过夜。13 次日,配制1%琼脂糖凝胶;每个样品相对应地在PE手套上点上6loading buffer约1l,每个样上样5l,与6loading buffer 混匀后,点湿样(可在电泳槽中将凝胶加样孔端没入电解液中,使加样孔中浸满电解液,再将混匀的样品加入点样孔。也可按上述操作在电泳槽外完成点样),1%琼脂糖凝胶电泳(小电泳槽:120V,18-20min;大电泳槽:150V,20min)。14 EB染色15-25min,清水漂洗,照相。15 根据照相结果保留提取成功的DNA样品并记录。
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