sop-叶酸
5页1、 叶酸代谢叶酸代谢能力能力(MTHFR)基因型检测基因型检测 1. 项目名称:项目名称:叶酸代谢能力(MTHFR)基因型检测 2. 实验原理:实验原理: 应用一对双标记 Taqman 探针,分别针对双等位 SNP 的不同基因型,只有完全匹配的探针 扩增出各自对应的基因型;用两种荧光染料 Fam,Hex(Vic)分别标记这两种探针,就可 以在一次 PCR 反应中完成对单个 SNP 位点的基因型判定。 3. 试剂:试剂: 3.1 TIANGEN 血液基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Blood DNA Kit DP318),规格为50 次/盒,保存于室温。有效期12个月,在效期内使用试剂。 名称 含量 名称 含量 细胞裂解液CL 60 ml 洗脱缓冲液TB 15 ml 缓冲液GS 15 ml Proteinase K 1 ml 缓冲液GB 15 ml 吸附柱CB3 50 个 缓冲液GD 13 ml 收集管 50 个 漂洗液PW 15 ml 1.5 50 个 3.2 江西诺德医疗器械有限公司的叶酸代谢能力测定试剂盒,规格为 200 测试/盒(6l 体 系,如 20l 体系则为 50 测
2、试) ,-20保存。有效期 12 个月,在有效期内使用。 名称 成分 含量 荧光基团预混液 MTHFR A1298C 位点试剂 1 ml 荧光基团预混液 MTHFR C677T 位点试剂 1 ml 纯化水 阴性 1 ml 阳性样本 1-A MTHFR A1298C-CC(突变纯合) 60 阳性样本 1-B MTHFR A1298C-AC(突变杂合) 60 阳性样本 1-C MTHFR A1298C-AA(野生型) 60 阳性样本 2-A MTHFR C677T-CC(野生型) 60 阳性样本 2-B MTHFR C677T-CT(突变杂合) 60 阳性样本 2-C MTHFR C677T-TT (突变纯合) 60 4. 仪器:仪器: 4.1 离心机 4.2 荧光定量 PCR 仪 5. 方法:方法: Taqman 探针法 6. 操作步骤:操作步骤: 6.1 对标本进行编号,并录入 LIS 系统; 6.2 样本处理: 使用前先在缓冲液 GD 和漂洗液 PW 中加入无水乙醇,加入体积请参照瓶上的标签。 6.2.1 在离心管中加入 200L 血液: 6.2.2 加入 20 l Proteina
3、se K 溶液,混匀。 6.2.3 加 200 l 缓冲液 GB, 充分颠倒混匀, 56放置 10 min, 其间颠倒混匀数次。 (水 浴后颜色可能为深褐色,注意溶液中没有团块等沉淀。) 6.2.4 加 200 l 无水乙醇,充分颠倒混匀,此时可能会出现絮状沉淀。 6.2.5 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱 CB3 中(吸附柱 CB3 放入收集 管中),12,000 rpm(13,400g)离心 30 sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱 CB3 放入收集 管中。 6.2.6 向吸附柱CB3中加入500 l缓冲液GD (使用前请先检查是否已加入无水乙醇) , 12,000 rpm(13,400g)离心 30 sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱 CB3 放入收集管中。 6.2.7 向吸附柱 CB3 中加入 600 l 漂洗液 PW (使用前请先检查是否已加入无水乙醇) , 12,000 rpm(13,400g)离心 30 sec,倒掉收集管中的废液,将吸附柱 CB3 放入收集管中。 6.2.8 重复操作步骤 7。 6.2.9 12,000 rpm(13,400g)离心 2
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