bmp-bfgf生物活性材料修复关节软骨损伤的实验研究

1、BMP/bFGF生物活性材料修复关节软骨损伤的实验研究 作者：林佳声，赵承斌，李华哲【摘要】 目的探讨骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)生物材料在关节软骨缺损修复过程中的作用,为内源性修复关节软骨缺损提供实验基础。方法取24只14龄成年大白兔随机分成4组，每只动物于双侧膝关节股骨膑股关节面制备直径5mm全层关节软骨缺损模型。钻通骨髓腔。A组应用BMP/ bFGF生物活性材料，B组应用BMP生物活性材料，C组应用bFGF生物活性材料，D组单纯应用生物蛋白胶材料。于8、12、24周在大体，光镜及电镜下观察损伤修复效果，组织学评分。 结果A组于8、12周时，软骨缺损被白色半透明坚硬组织平滑修复，富有光泽，24周时修复组织正常软骨边界模糊，连接紧密，质地坚硬，表面平滑光润。B、C组于8、12、24周时候均未见软骨缺损完全修复，边界清楚，中央凹陷明显残留。D组全程均未见软骨修复。组织学平分A组明显优于B、C、D组，而B、C组之间无差别。结论BMP/bFGF

2、生物活性材料可以有效修复兔大面积关节软骨损伤，疗效明显优于单独应用骨形态发生蛋白或碱性成纤维细胞生长因子，为关节软骨损伤治疗提供新的治疗方法。 【关键词】 骨形态发生蛋白； 碱性成纤维细胞生长因子； 软骨缺损； 生物蛋白 Abstract：ObjectiveTo study the repair of articular cartilage defects with combined bone morphogenetic protein(BMP)/basic fibroblast growth factor (bFGF) biomaterial in order to supply experimental basis for repairing cartilage defects biologically.MethodTwentyfour 14weekold rabbits were randomly divided into four groups,BMP/bFGF biomaterial gel(group A), BMP biomaterial gel (group B), b

3、FGF biomaterial gel(group C) and simple fibrin glue treated group (group D).A couple of knees of each rabbit experienced 5 mmdiameterfull cartilage resection and drilling throuth of bone marrow.Gross appearance,histologicol section and electron microscope were axamined at 8,12,24 weeks after operation.ResultIn group A the cartilage defects were smoothly repaired by white translucent hard tissue at 8 and 12 weeks,and defect boundary was hard to be indentified with normal cartilage at 24 weks. No

4、smooth repairing was observered in B,C and D groups. Group A got a better histological score than B,C and group D(P<0.05). No difference exited between B and C groups (P>0.05).ConclusionCombined BMP/bFGF biomaterial is good for repair of articular cartilage defects and has better result than using BMP or bFGF alone.These results may provide a therapy for articular cartilage defects. Key words：bone morphogenetic protein; fibroblast growth factor; basic defects of cartilage; fibrin glue 关节软骨

5、缺损是临床常见疾病，病人会出现关节疼痛及运动障碍，最终引起骨性关节炎。 关节软骨缺损的修复是骨科研究的热点。目前常用的是外源性修复方法，如钻孔术、骨膜和软骨膜移植、细胞移植、骨软骨移植等，尽管软骨细胞移植在理论上更为有利，但依照国内外实际情况，自体软骨细胞回植的治疗方法在取材，培养，防止污染和经费方面都有困难，而且疗效也并不完美1。随着分子生物学研究的进展，发现软骨缺损的修复过程是一个多种因子参与的复杂过程。所以本研究基于临床实际情况，利用有效生物活性材料，为内源性软骨修复提供实验参考。 1 实验方法 1.1 实验材料 14周龄哈尔滨大白兔24只，哈尔滨医科大学附属第一医院动物实验中心提供；医用生物蛋白胶， 广州倍绣生物技术有限公司；重组人碱性成纤维细胞生长因子，美国invitrogen生物有限公司； 牛天然骨形态发生蛋白，天津中津生物发展有限公司；戊巴比妥钠， 上海化学试剂厂。 1.2 BMP和bFGF生物蛋白胶复合材料的制备2 溶解60 mg/ml纤维蛋白原(50 000 u/ml和500 mg/ml)1 ml，准备凝血酶原溶液(500 u/ml)1 ml。改进共推注射器，控制其微

6、量出液。纤维蛋白原和凝血酶原组通过“Y”形针头混合后立即成为固体状态。 30 mg骨形态发生蛋白溶于2 mL 4 mol/L盐酸胍、10.05 mol/L氯化钙溶液中,兑水透析24 h，备用。如果需要保存，将稀释液在-20C条件下贮存。 先用0.1%胎牛血清蛋白1 ml溶解0.1 mg碱性成纤维细胞生长因子（防止碱性成纤维细胞生长因子粘附于安瓶内），将稀释液溶解于1 ml Tris液备用。如果需要保存，将稀释液在-20C条件下贮存。 1.3 模型制备 1.3.1 动物分组 A组6只，利用BMP/bFGF生物活性材料治疗（n=12）；B组6只，BMP生物活性材料治疗；C组6只，bFGF生物活性材料治疗（n=12）；D组6只,生物活性材料治疗（n=12）。 1.3.2 动物建摸 全麻（2%戊巴比妥钠1.2 mL/kg耳缘静脉麻醉）,双膝关节常规备皮、消毒，铺巾。取膝关节内侧小切口，向上向下少许锐性分离，屈曲膝关节将髌骨脱位于外侧，暴露股骨滑车关节面，制造直径5 mm、深3 mm的圆形全层软骨缺损。同时钻通骨髓腔。充分止血，利用共推针头注入各组活性材料，填满缺损。细致休整表面。冲洗，逐层缝合

7、。对侧操作同上。术后置于标准动物实验笼中，每日活动，加强锻炼。术后8 、12 、24周每组空气处死2只动物，观察大体、光镜、电镜指标。 1.4 观察指标 1.4.1 一般观察 术后步态，膝关节活动范围，切口情况，动物大体状态和进食情况。 1.4.2 关节修复的大体观察 表面平整与否，色泽，质地，与临近软骨结合情况。 1.4.3 光镜观察 10甲醛固定，0.1 mol/L EDTA脱钙，梯度逐级脱水，缺损区纵形剖开石蜡包埋，4 m超薄切片。HE、PAS染色，观察组织形态和蛋白多糖沉积情况。 1.4.4 扫描电镜观察 标本取材后纵行剖开，磷酸盐缓冲液漂洗，戊二醛溶液固定，置入锇酸2 h,洗净，逐级脱水，临界点干燥，喷金后电镜观察。 1.4.5 组织学评分 根据Wakitani等制定的评分标准，采用双盲法对各标本进行组织学评价。 2 结 果 2.1 BMP/bFGF生物蛋白胶的制备 在20左右的室温条件下，bFGF及 BMP溶液可以很好的溶解于纤维蛋白原中成为透明液体，与凝血酶混合后，于5 s内迅速凝结，成为固态胶体。材料白色半透明，富于光泽，质地松软而脆弱，充填于软骨缺损部可以很好的适应软

8、骨的曲线，并可将修饰得非常平滑。注射过程应该均匀而快速，注于缺损部后待凝胶成型后，注意休整表面与正常关节面一致。 2.2 大体形态和一般状况 所有动物均无膝关节感染和积液发生。A组只，B组只，C组只动物跛行（4周左右），关节活动受限。余所有动物均未见跛行，其膝关节活动范围较术前无明显改变，表现活跃，食欲佳。大体观察，A组：软骨缺损区均为修复组织所充填，表面光滑，半透明状而有光泽。术后8周修复组织成白色，质地坚韧，与周围组织结合紧密，但可清楚的显示界限，表面平滑与关节面曲线配合完善；术后12周修复组织仍成白色坚韧组织，与周围组织融为一体，边界趋与模糊，表面更趋平整；术后24周修复组织成为白色半透明软骨样组织，与周围软骨结合为一体，表面稍微凹陷，关节表面平滑，坚硬。B组，C组：术后8、12、24周均未出现完整平滑关节面修复现象，表面凹凸不平，只是在缺损边缘有部分修复组织出现，中央缺损长期存在，被暗红色疏松结缔组织充填，修复组织与正常软骨界限清楚。D组也完全没有出现修复现象出现 。 2.3 组织学观察 A组：术后8周，HE染色见缺损已经被明显修复，大量软骨细胞出现，圆形和椭形胞核清晰，有软骨

9、陷凹出现，修复组织与关节缺损边缘软骨结合紧密，PAS染色见基质出现蓝染，糖胺多糖类物质开始大量沉积；术后12周，修复组织厚于正常软骨，修复组织与其结合紧密，以类透明软骨细胞为主，大量增殖，软骨陷窝大量出现，表层软骨细胞稀疏体积小，而底层细胞量多且较为巨大，呈现分层分布的特点，基质PAS染色见明显蓝染，糖胺多糖类物质沉积更为明显；术后24周，软骨厚度稍变薄，软骨陷窝明显，修复组织与正常软骨界限模糊，结合紧密，蛋白多糖类物质明显沉积，部分区域出现纤维软骨特点。B组、C组：术后缺损未被有效修复，中央凹陷表面长期残留，缺损内部被大量肉芽组织填充，边壁出现骨板，基质染色见少数靠近骨板的局部出现软骨基质沉积。D组：8、12、24周术后软骨缺损长期存在，缺损处被大量肉芽组织所填充。质地松软，与周围无明显连接，HE染色未见软骨细胞出现，PAS染色未见糖胺多糖类物质沉积。 2.4 电镜下观察 A组术后8、12周电镜下表层可见纵行排列的软骨细胞、软骨囊,软骨细胞之间可见间隙及成熟的软骨基质，部分软骨钙化；术后24周组:电镜下软骨基质胶原排列规则，软骨厚度均匀，软骨下方为排列规则的骨髓腔（图111）。 2.5 组织学评分 双盲法测定，结果显示，A组（1.920.69）明显优于B组（3.580.67），C组(3.330.89)及D组(12.451.05)。SPSS13.0软件进行方差分析，A组和B 、C 、D 3组均存在显著性差异(P<0.05) ；B、C、D组存在显著性差异(P<0.05)；而B组和C组没有统计学差异(P>0.05)。 图1 BMP/bFGF生物活性材料组术后8周大体观察 图2 BMP/bFGF生物活性材料组术后12周大体观察 图3 BMP/bFGF生物活性材料组术后24周大体观察 图4 BMP/bFGF生活活性材料组术后8周（HE染色40） 图5 BMP/b

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