免疫荧光实验步骤
3页1、免疫荧光实验步骤 V b3 e) h: r; _* E9 M3 X r0 Z. S2 1. 直接免疫荧光法测抗原* _4 Q9 A+ c3 Q: w s: N(1)基本原理, R$ X4 ! ( 1 J将荧光素标记在相应的抗体上,直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低;而且每检查一种抗原就需要制备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。8 J( W# I4 O& E/ o2 P(2)试剂与仪器5 Y2 ?3 $ T( a* gl 磷酸盐缓冲盐水(PBS):0.01mol/L,pH7.4 P7 W) S7 C; Y f8 |0 ! O- W 荧光标记的抗体溶液:以0.01mol/L,pH7.4的PBS进行稀释l8 R7 a; q7 p5 o1 缓冲甘油:分析纯无荧光的甘油9份+ pH9.2l 0.2M碳酸盐缓冲液1份配制# t3 j8 g! p* W7 X) g$ F 搪瓷桶三只(内有0.01mol/L,pH7.4的PBS 1500ml)l1 D) & |) 5 h0 G C 有盖搪瓷盒一只(内
2、铺一层浸湿的纱布垫)l3 7 b% d# x6 N& A+ A7 g. o/ w: O 荧光显微镜l# l: f X; m+ x! |% Q 玻片架l G8 o2 1 W+ M3 s) _ B 滤纸l% J! b+ F1 F/ | v vl 37温箱等。* r9 U , H) b* 3 W4 q(3)实验步骤0 Y z+ ! O! R9 x2 Y2 X: D 滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于待检标本片上,10min后弃去,使标本保持一定湿度。6 R, B6 X/ Y5 5 e; P 滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液,使其完全覆盖标本,置于有盖搪瓷盒内,保温一定时间(参考:30min)。* + R6 J g. g 取出玻片,置玻片架上,先用0.01mol/L,pH7.4的PBS冲洗后,再按顺序过0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡,每缸3-5 min,不时振荡。) s5 & L% A$ M( ) 取出玻片,用滤纸吸去多余水分,但不使标本干燥,加一滴缓冲甘油,以盖玻片覆盖。) O9 A # N. F 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度,一般可用“+”表示:
3、 M9 d6 j- . S: 1 n(-)无荧光;()极弱的可疑荧光;(+)荧光较弱,但清楚可见;(+)荧光明亮;(+ -+)荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“+”以上,而各种对照显示为()或(-),即可判定为阳性。6 q& % p/ r b* V(4)注意事项% C# U2 v$ M9 $ W& W1)对荧光标记的抗体的稀释,要保证抗体的蛋白有一定的浓度,一般稀释度不应超过1:20,抗体浓度过低,会导致产生的荧光过弱,影响结果的观察。/ 7 e% y3 M P3 n7 z; t2)染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化,染色时间可以从10 min到数小时,一般30 min已足够。染色温度多采用室温(25左右),高于37可加强染色效果,但对不耐热的抗原(如流行性乙型脑炎病毒)可采用0-2的低温,延长染色时间。低温染色过夜较3730 min效果好的多。! e* / P; L 4 l5 U4 _3)为了保证荧光染色的正确性,首次试验时需设置下述对照,以排除某些非特异性荧光染色的干扰。0 ) D7 i: I% Y$ v% f) u5 W 标本自发荧光对照:标本加1-2滴0.
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