实验六 植物组织基因组dna的提取与分析(ctab法)
12页1、1,实验六 植物组织中DNA的提取与分析,温馨提示:1、请将教室水浴锅打开,温度调至65。2、实验中-20冰浴时,请将样品放入6309室冰箱冷冻层。,2,(1)掌握植物组织中DNA提取的原理和方法。 (2)掌握DNA的琼脂糖凝胶电泳检测方法,一、实验目的,二、实验原理,通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞,由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响,在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨,材料易于破碎,并减少研磨过程中各种酶类的作用。 CTAB, SDS等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,从而使DNA得以游离出来。,二、实验原理,再加入苯酚和氯仿等有机溶剂,能使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。 上清液中加入异丙醇或乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中,即得植物总DNA溶液。 之后可加入RNA酶降解其中的RNA,再用氯仿除去RNA酶,得到较纯的DNA制剂。,CTAB法流程图:,6,三、仪
2、器和试剂,1、仪器: 恒温水浴锅、高速离心机、水平电泳槽、电泳仪。 2、试剂: 液氮、CTAB提取缓冲液、氯仿:异戊醇(24:1)、异丙醇、70%乙醇、TE缓冲液、上样缓冲液(0.5%溴酚蓝+40%蔗糖)、1TAE电泳缓冲液。,四、实验步骤,1、DNA的提取,8,四、实验步骤,2、DNA电泳检测 (1)1%琼脂糖凝胶:称取0.3g琼脂糖,加入30mL 1TAE缓冲液,在微波炉中加热,反复加热、振荡2-3次,使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至60左右,倒入插入梳子的凝胶板中(避免产生气泡),让凝胶自然凝固。 (2)待凝胶凝固后,小心拔出梳子,避免前后左右摇晃,以免破坏胶面及加样孔,小心将凝胶和胶床放入电泳槽中,加样孔靠近阴极的一端。,9,四、实验步骤,2、DNA电泳检测 (3)上样电泳:将20LDNA样品溶液和5L上样缓冲液混匀后,上样,100V稳压电泳检查,根据指示剂迁移的位置,判断是否中止电泳。切断电源后,再取出凝胶。 (4)照胶、拍照:将凝胶泡在EB溶液(注意:EB溶液为剧毒物,需带上一次性手套拿取凝胶)中10min左右,进入暗室,使用凝胶成像系统照胶并拍照。,10,五、实验结果与分析,将凝胶图片打印出来,需要说明: 1、小组点样孔号; 2、DNA质量分析。,六、注意事项,(1)叶片磨得越细越好。 (2)移液器的使用。 (3)由于植物细胞中含有大量的DNA酶,因此,除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外,第一步(研磨)的操作应迅速,以免组织解冻,导致细胞裂解,释放出DNA酶,使DNA降解。,12,1、在DNA抽提过程中造成DNA分子断裂的主要因素有哪些? 2、本实验中所用到下列试剂(CTAB、氯仿、异丙醇、75%乙醇)的作用各是什么?,七、思考题,
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