免疫学实验二 elisa(双抗夹心法)
23页1、实验二、酶联免疫吸附试验,实验内容: 间接法 测乙型肝炎病毒表面抗体(HBsAb),Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA,酶联免疫吸附试验(ELISA)是将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的实验技术,可用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原。首先,抗原、抗体的特异性反应在一种固相载体表面聚苯乙烯微量反应板孔中进行,通过洗涤去除多余的游离反应物;然后加入酶标记的抗体或酶标记的抗抗体,从而形成抗体抗原酶标抗体复合物(双抗体夹心法)或抗原抗体抗抗体复合物(间接法);此时加入酶底物和显色剂,在酶催化底物后,液体呈现显色反应。液体显色的强弱与复合物中待测抗原或抗体的量呈正比,借此可检测待测抗原或抗体的有无及含量。 该技术的特点是敏感性高,特异性强,操作简易,结果容易观察。,实验原理:,免疫酶技术是利用酶标记抗体或抗原,以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。其原理是酶与抗体或抗原结合后既不改变抗体或抗原的特异性及免疫反应性,也不影响酶的催化效能。当存在相应酶底物时,酶能催化产生有颜色的产物,颜色的有无及深浅能反映相应的
2、抗原或抗体是否存在及其量的多少。,实验原理:,ELISA的测定方法包括:,双抗体夹心法:检测抗原最常用的方法,间接法:检测抗体最常用的方法,竞争法:既可检测抗原,亦可检测抗体,生物素亲和素系统ELISA法:是在ELISA中引入生物素或亲和素放大系统,检测极微量的抗原或抗体的方法。,直接法,间接法,BAS-ELISA,底物,1.已知Ab包被固相,2.加待检标本,3.加生物素标记的特异性抗体,4.加酶标记的亲和素,5.加底物显色,亲和素,酶,生物素,待检标本,biotin-avidin-system,生物素-亲和素系统 此法敏感性更高。用于抗原抗体以及DNA、RNA的检测。,材料和试剂:,1. HBsAg、包被液。 2.待检人血清。 3.酶标记的抗HBsAb抗体。 4.HBsAb阳性对照血清、HBsAb阴性对照血清 5.洗涤液:PH7.4 0.01mol/L PBS-吐温20。 6.底物溶液:OPD-H2O2或TMD-H2O2。 7.终止液:2mol/L H2SO4。 8. 酶标反应板、移液器、恒温箱、酶标仪,酶标板,移液器,酶标仪,操作步骤:,包被:将HBsAg用包被液作适当稀释(1:1
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