免疫检测技术
53页1、,第九章,免疫检测技术,免疫检测是目前生物学检测方法中用途最广泛的一种方法。 具有高度精确、灵敏、特异的特点。 可用于免疫学的基础理论和应用研究,也可应用于生物学研究的各个领域。,1 、免疫疾病诊断 2 、动物植物生理活动研究(激素、维生素) 3 、物种及微生物鉴定 4 、动物、植物性状的免疫标记 5 、免疫增强药物和疫苗的研究 6 、发病机理研究 7 、分子生物学研究,免疫检测技术在生物科学领域中的应用:,第一节 抗原抗体反应原理,抗体能特异性地识别相应的抗原,并与之结合。这种 结合在体外也能发生,当抗原和抗体在体外特异性结合后 可出现肉眼可见或借助仪器可检测出的反应现象。 试验时既可用已知抗体检测标本中有无相应抗原,也可用已知抗原检测标本中有无相应抗体。,这种特性就是许多免疫检测方法的基础!,一、体外抗原抗体反应的特点,特异性:抗原抗体反应具有高度的特异性。 可逆性:抗原抗体反应所形成的复合物较稳定, 但在一定条件下可解离。(低酸、高盐) 比例性:抗原抗体的比例合适,才可出现可见的 反应现象。(网格理论) 阶段性:特异性结合阶段和可见反应阶段。,网格理论解释抗原抗体形成沉淀的机制,
2、网格学说(lattice theory),抗体过剩,抗原过剩,抗体抗体比例合适,抗原,抗体,二、影响抗原抗体反应的因素,温度:在一定温度范围内,提高温度可加速反应 速度,缩短反应时间,常用反应温度为37-45。 溶液的pH:pH过高或过低可改变抗原和抗体理化 性质,影响反应结果,因此溶液的pH应适宜 (pH 6-8)。 电解质:反应中必须有适宜的电解质(0.85%NaCl) 参与,否则不出现可见反应。,三、抗原抗体反应类型,1.沉淀反应 2.凝集反应 3.补体参与的反应 4.中和反应 5.免疫标记技术,第二节 常见免疫检测方法,可溶性抗原(血清蛋白、病毒抗原、细胞裂解液或组织液等)与相应抗体结合,在一定条件下形成肉眼可见的沉淀物称沉淀反应。,一、免疫沉淀反应,一、免疫沉淀反应,1. 液相沉淀反应,2. 凝胶扩散沉淀,3. 凝胶免疫电泳,絮状沉淀,环状沉淀,免疫浊度沉淀,单向琼脂扩散试验,双向琼脂扩散试验,血清免疫电泳,火箭电泳,对流免疫电泳,免疫印迹等,絮状沉淀试验,操作步骤: (1) 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。 (2) 各管加入一定浓度的适量抗血清。 (3) 振摇使抗原、抗体充分
3、混匀,置37孵育。 (4) 产生沉淀量随抗原量而不同,以出现沉淀物最多的管为最适比例管。 絮状沉淀试验方法简单,设备要求低,敏感度较低,目前 多用以测定抗原抗体反应的最适比。,环状沉淀试验,操作步骤: (1) 用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管(550mm)底部,避免产生气泡。(已知!) (2) 将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上,形成清晰的交界面。(待测! ) (3) 置沉淀管于室温下使其反应,15min内在两界面间呈现乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性。 应用:主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。 (诊断炭疽的Ascoli实验、细菌分型、血迹鉴定)。,2. 凝胶扩散沉淀,凝胶扩散沉淀是指抗原与抗体在凝胶介质中自由扩散形成浓度梯度,抗原与抗体在比例合适的扩散部位相遇形成沉淀线的反应。 常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。 最常用的方法为: 单向琼脂扩散试验 双向琼脂扩散试验,单向琼脂扩散试验,原 理: 将适当浓度的抗体混入琼脂凝胶中,琼脂 凝固后,打成小孔,加入待测的抗原物质, 使抗原在凝胶中由小孔自由向周围扩散,并 在小孔周围合适的位
4、置与抗体结合形成沉 淀环,沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。,单向免疫扩散试验示意图,双向免疫扩散试验,双向免疫扩散试验是在琼脂板上按一定距离 打数个小孔,在相邻的两孔内分别放入抗原 和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩 散,在两孔间可出现23条沉淀线,本法常 用于抗原或抗体的定性或定量检测,或用于 两种抗原材料的抗原相关性分析。,3.免疫电泳技术,免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。 这种技术有两大优点:一是加快了沉淀反应的速度, 二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分 开,再分别与抗体反应,以此作更细微的分析。 免疫电泳包括:血清免疫电泳、对流免疫电泳、 火箭电泳、免疫印迹等,血清免疫电泳,将抗原混合物(病人血清)在凝胶中用电泳 分离后,沿电泳方向挖一平行的小槽,加入 抗血清,进行双向扩散。沉淀线的特点显示 病人血清与正常人血清存在的差异,即血清 蛋白组分的缺少或增加。,免疫电泳原理图解,火箭免疫电泳,火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散 免疫沉淀试验,它是由单向扩散发展起 来的一项定量技术,实质上是加速度的 单向扩散。,沉淀线的高度与抗原量成正比,火箭电泳图,二、凝集
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