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间接免疫荧光法实验操作常见问题(20110524)

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  • 常见问题
    • 1、,间接免疫荧光法实验操作常见问题 及解决方法,间接免疫荧光法所遇问题的解决方法,实验操作 避免错误 识别错误的来源,准备 稀释 加样 血清温育 清洗,间接免疫荧光法操作流程(1),1 sec flush 1 min cuvette,间接免疫荧光法操作流程(2),加荧光标记抗体 温育 清洗 封片 结果判断,1 sec flush 1 min cuvette,间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (1),清洁工作台 用通常的家用洗涤剂和蒸馏水清洗加样板的反应区,用纸巾吸干。 在作某些特殊检测时需要使用消毒液清洗加样板。 只有当生物薄片载片平衡到室温后方可打开包装。 可用防水的黑色标记笔在生物薄片载片的正面作标记。 只能在手可触摸的区域作标记。 不要触摸生物薄片。,实验准备阶段:,间接免疫荧光法工作台的布置,间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (2),样本稀释阶段:,在稀释前用旋涡混匀器混匀标本。 用可靠的去离子水配置PBS-吐温缓冲液。 确保已稀释标本的量足够用于所计划的所有实验。 用PBS-吐温缓冲液稀释病人标本。,间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (3),应把窗户关上,以避

      2、免已稀释样本的蒸发。 因塑料制品会吸附抗体,造成抗体浓度的下降,所以最好用玻璃管稀释样本。 将样本滴加在加样板的反应区。 加样量要准确。 避免产生气泡。 加完所有样本后方可开始温育。,滴加样本至加样板的反应区:,间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (4),确保液滴与生物薄片接触良好。 避免样本之间相互接触。 避免快速移动加样板。 确保生物薄片与加样板的反应区吻合良好。 避免缩短或延长温育时间。,血清温育阶段:,间接免疫荧光法问题的解决方法(5),用PBS-吐温缓冲液流水迅速冲洗载片 (用大口杯,不要用细颈瓶)。 流水冲洗载片后立即放进盛有PBS-吐温缓冲液的小杯中浸洗。,清洗:,清洗,间接免疫荧光法问题的解决方法(6),荧光二抗直接使用 不要将结合物放在阳光直射处。,荧光素标记的二抗(结合物)的使用:,间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免 (7),从小杯中垂直取出载片。 用事先叠好的纸巾从背面擦拭载片。 不要擦拭反应区之间的间隙。 5秒钟内进行第二次温育。 从现在开始,避免阳光直射载片,直至实验结束。,载片在第一次清洗后的处理:,载片的擦拭,间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免

      3、 (8),可用聚苯乙烯封片板。 盖玻片上每反应区滴加PBS-甘油8ul,不要超过10ul。 用纸巾擦拭载片的背面和四周,不要擦拭反应区间隙。 将载片有生物薄片的一面朝下,盖在已准备好的盖玻片上,将盖玻片粘起来。 立即检查盖玻片与载片是否吻合良好 ,必要时可调整盖玻片的位置。,封片:,封片,间接免疫荧光法问题的解决方法错误的避免(9),将荧光显微镜放置在光线比较暗的房间。 使用合适的目镜和滤光片。 判断组织用的目镜有:20x,dry, Apertur 0,6 e. g. Planapochromat, Plan Neofluar (Zeiss), HC PL Fluotar (Leica) objectives for evaluation of cells: 40x, dry, Apertur 0,7 e. g. Plan Neofluar (Zeiss), HCX PL Fluotar (Leica) filters: e. g. Exciting filter 450-490 nm, Suppression filter Long-Pass 520 nm 确保光线合适。 如果模板片

      4、中ANA的荧光模型不能达到预期的强度,应更换灯泡。,结果判断:,间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(1),当出现问题时,我们应该检查: 组织切片完整与否。 基质是否有缺损。 组织形态是否完整。 ,间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(2),当出现问题时,我们应该: 重做实验,以排除实验操作中的错误。,间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(1),当出现问题时,我们应该检查是否有: 图像不清 气泡 荧光强度减弱 组织有非特异反应 组织根本不反应,间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(2),镜下图像不清 主要的原因: 封片基质过量。 盖玻片与载片吻合不好。 目镜的镜头模糊不清。 使用了两张盖玻片。 盖玻片表面模糊不清。 盖玻片表面有水滴。 显微镜有问题。,间接免疫荧光法问题的解决方法辨别错误的 来源(3),气泡: 封片不正确。 除去封片基质中的气体。,荧光强度减弱: 主要的原因: 显微镜调整的不合适。 本来应直接使用的血清又作了进一步的稀释。 荧光素标记的二抗暴露在阳光直射处。 温育后的载片暴露在阳光直射处。,间接免疫荧光法问题的解决方法辨别错误的来源(4)

      5、,间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(5),组织有非特异性反应 主要的原因: 在显微镜镜检过程中生物薄片区域被淬灭。 温育过程中有气泡产生。 温育过程中有液体蒸发。 有肉眼可见的FITC结晶。,显微镜镜检过程中生物薄片被淬灭,温育过程中有气泡,温育过程中有液体蒸发,间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(6),按传统的方法温育: 有肉眼可见的FITC结晶。 用滴定平板技术温育: 没有FITC结晶。,间接免疫荧光法问题的解决方法辨别问题的 来源(7),组织切片没有任何反应 主要的原因: 在温育过程中有血清或二抗的丢失。 缓冲液质量不好。,由刮或擦拭所引起的基质损坏,由于挤压所引起的基质损坏,由于掀盖玻片所引起的基质损坏,灰尘颗粒,组织折叠,没有进行血清温育,没有进行二抗温育,载片过度干燥(1) (血清温育后5分钟Hep-2细胞),对照,过度干燥,参照,过度干燥,载片过度干燥(2) (血清温育后5分钟猴肝),Trocknung nach Konjugatschritt BIOCHIP Mitte (20er),参照,载片过度干燥(3) (酶结合物温育后5分钟),过度干燥,载片保存不当 (温度或湿度过高),参照,温度或湿度过高,使用自来水配置PBS-吐温缓冲液,正常操作,使用自来水配置 PBS-吐温缓冲液: 细胞不清晰,背景不干净,使用蒸馏水清洗浸泡载片,正常操作,使用蒸馏水清洗浸泡载片: 细胞肿胀变形,滴度下降,PBS-吐温缓冲液常温(25)放置1周,正常操作,PBS吐温缓冲液 常温放置1周: 背景不干净,缓冲液配置只使用PBS,正常操作,缓冲液配置只使用PBS: 背景不干净,1:100滴度结果变阴性,清洗时只冲洗不浸泡,正常操作,清洗时只冲洗不浸泡: 结果转阴,可能出现 Hep-2阴性,肝片阳性 结果,酶结合物1:10稀释,正常操作,酶结合物1:10稀释: 中滴度结果转阴,二抗加样量过多,正常操作,二抗加样30ul: 荧光有增强,二抗加样量少,正常操作,二抗加样量为15ul: 荧光减弱,37温育,正常操作,37温育: 反应性增强,滴度升高,

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