分子生物学：蛋白质组学的研究方法和进展

1、萧 小 鹃 jocelyn_ 分子生物学研究中心,第九章 蛋白质组学的研究方法和进展,分子生物学 Medical Molecular Biology,One Genome different Proteomes,Life is based on proteins and their interactions,从基因组学到蛋白质组学,20世纪生命科学的辉煌成就 1953年,Watson & Crick提出DNA双螺旋结构 1957年，“中心法则”的问世 20世纪90年代，人类基因组计划（HGP）,基因组计划的局限 无法解决“基因精细调控”问题 大规模基因表达检测技术如：微阵列法、DNA芯片及SAGE “mRNA” 无法反映蛋白质的质与量。,以往人类对于蛋白质的研究只是针对生命活动中某一种或某几种蛋白质，难以形成一种整体观，难以系统透彻地阐释生命活动的基本机制。,基因是遗传信息的源头 功能性蛋白是基因功能的执行体,大规模、全方位的蛋白质研究势在必行,后基因组时代 功能基因组学成为研究重心 蛋白质组学是其“中流砥柱”，成为战略制高点,第一节 蛋白质组学的概念及其发展史,什么是蛋白质组？,蛋白

2、质组 “proteome”一词源于“PROTEin”与“genOME”的杂合。,同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同 在空间和时间上动态变化,指由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部蛋白质。,蛋白质组学(proteomics),应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学。 从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。,主要研究内容,了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；,明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络；,描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。,什么是功能蛋白质组学？ (functional proteomics),功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。 介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。,蛋白质组学应用举例,研究细胞结构功能和分子组成,发现新的药物靶位点,发现新型生物学活性的分子和药物,差异蛋白质组学,发现细菌、病毒感染和疾病监测的分子标志物,修饰

3、蛋白质组学,遗传或药理学扰动的分子解剖,病理生理学研究,植物蛋白质组学,相互作用蛋白质组学,研究药物作用方式和毒性机理,进 展（国际）,1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（APAF） 美国NCI肺、直肠、乳腺和卵巢等肿瘤的蛋白质组数据库 NCI与FDA有关癌症不同发病阶段和治疗阶段的蛋白质组数据库 英国、法国、德国、日本等国也分别投入巨资进行蛋白质组学的研究 此外，Celera公司、日内瓦蛋白质组公司与布鲁克质谱仪制造公司也开始参与研究,The HUPO World,Canada,USA,China,Japan,Korea,Asia Oceania,Sweden,Russia,United Kingdom,Italy,Germany,France,Latin America,Australia,The Human Proteome Organisation,1. Human Liver Proteome Project(HLPP) 2. Human Brain Proteome Project(HBPP) 3. Proteomic Standards Initiat

4、ive(PSI) 4. Human Antibody Initiative(HAI) 5. Human Plasma proteome Project(HPPP) 6. Mouse Models Human Disease(MMHD) 7. Human Disease Glycomics/Proteome Initiative (HGPI) 8. HUPO Cardiovascular Initiative(HUPO CVI),进 展（国内）,国家自然科学基金委于1997年设立了重大项目“蛋白质组学技术体系的建立” 1998年启动了蛋白质组学研究 中国科学院生物化学研究所、军事医学科学院与湖南师范大学已启动蛋白质组研究 中国科学院上海生命科学研究院、军事医学科学院与复旦大学相继成立了专门的蛋白质组学研究中心,科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。 我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展,第二节 蛋白质组学研究方法概述,一、蛋白质组表达模式研究方法,研究蛋白质组的组成成分

5、 主要技术有双向凝胶电泳、以质谱为代表的蛋白质鉴定技术及生物信息学技术。,Proteomics Technologies,Biochemical techniques,Mass spectrometry Analysis,Bioinformatics,Protein Identification,（一）蛋白质组研究中的样品制备,采用细胞或组织的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。 进行样品预分级，将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究，可提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。,样品预分级的主要依据,蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等 蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等 蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等,组织水平蛋白质组样品制备,原因：临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤组织中癌变的上皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。,激光捕获显微切割 (laser capture microdissection，LCM),可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。,LCM纯化肺腺癌细胞,A：LCM切割前的肺腺癌组织； B：LCM切割后肺腺癌组织；C：收

6、集的肺腺癌细胞,肺腺癌转移相关蛋白质的筛选,A,B,C,（二）蛋白质组研究中的样品分离,关键技术：双向凝胶电泳 （two-dimensional electrophoresis，2-DE) 利用蛋白质等电点和分子量差异，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。,工作原理： 根据蛋白质等电点的不同进行第一向等电聚焦电泳分离 转移到二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，再根据相对分子量大小不同进行分离,等电聚焦电泳进行过程中,等电聚焦电泳结束后,（）,（）,（）,（）,低pH,低pH,高pH,高pH,等电聚焦电泳（ isoelectrophoresis focusing, IEF） 聚丙烯酰胺凝胶内的缓冲液在电场作用下沿电场方向在凝胶内制造一个pH梯度。每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处。,第一向IEF电泳,固相pH梯度等电聚焦的优点,克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。 可以随意精确设定pH梯度。 尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。,双向凝胶垂直电泳 双向电泳后的凝胶经染色后蛋白呈现二维分布图： 水平方向反映出蛋白在pI上的差异， 垂直方向反映出它们在

7、分子量上的差别。,第二向SDS-PAGE电泳,双向电泳方法的主要步骤： 1. 样品准备 2. 第一向：固相pH梯度等电聚焦 3. 第二向：SDS-PAGE电泳 4. 染色： 考马氏亮兰或银染 5. 图像分析：肉眼或自动扫描,Isoelectric Focusing (IEF) with IPG strips,固相pH梯度等电聚焦电泳（第一向）示意图,IEF,SDS- PAGE,Second Dimension: SDS-PAGE,SDS-PAGE电泳（第二向）示意图,Gel staining,Expression Proteomics with 2D Gel Electrophoresis,Dysfunctions, Cancer,Drugs,Simultaneous protein profiling to understand the function and regulation of thousands of proteins,Cell specific expression,Temperature,Metabolic state,Stress,Culture conditio

8、ns,Expression Proteomics with 2D Gel Electrophoresis,Differential Expression,A,B,E. Coli grown at 30 C,E. Coli grown at 42 C,Differential Analysis,Proteins from cultured human cells A = Derivative of B,Protein samples courtesy of Dr. Steven Seeholzer, Fox Chase Cancer Center,A,B,Data evaluation,Control sample,Treated sample,3-4 replicate gels have to be run for each sample,Matching,Standard Map,Data evaluation,Data evaluation,2D Gel Databases,Biobase 角质形成细胞,膀胱癌等 (丹麦Center for Genome Research) ht

9、tp:/biobase.dk/cgi-bin/celis ECO2DBASE 大肠杆菌 (在NCBI库中) ftp:/ncbi.nlm.nih.gov/respository/ECO2DBASE Heart-2DPAGE 人心肌 (德国柏林) http:/www.chemie.fu-berlin.de/user/pleiss HSC-2DPAGE 人类心脏 (英国Harefield, Heart Science Center) http:/www.harefield.nthames.nhs.uk/nhli/protein/index.html LSB 人类,小鼠和大鼠肝脏等 (美国Large Scale Biology) http:/.2dmaps/patterns.html QUESTRef52 细胞,大鼠胚胎,酵母 (美国Cold Spring Harbor Lab) http:/siva.cshl.org/ SWISS-2DPAGE 十个人类图谱,包括: 肝, 浆细胞, 红细胞, 血小板, 以及酵母, 大肠杆菌 (瑞士日内瓦, University Hospital)2-DE数据库http:/expasy.hcuge.ch/ch2d/ch2d-top.html Yeast S. cerevisiae, S. pombe等 (瑞典Goteborg University) http:/yeast-2dpage.gmm.gu.se/ Yeast S. cerevisiae (美国Proteome Inc.) http:/ kD分子量的蛋白质 高灵敏度和高分辨率 便于计算机进行图像分析处理 与质谱分析匹配,2-DE技术的缺点,极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。 胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。,新型非凝胶技术,液相色谱法 liquid chromat

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