4-显微镜及荧光显微镜原理
63页1、1,一 光学显微镜 的历史,17世纪中叶,英国的胡克和荷兰的列文胡克,都对显微镜的发展作出了卓越的贡献。 1665年前后,胡克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台。这些部件经过不断改进,成为现代显微镜的基本组成部分。,16731677年期间,列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜,其中九台保存至今。胡克和列文胡克利用自制的显微镜,在动、植物机体微观结构的研究方面取得了杰出成就。,Abbe & Zeiss,Ernst Abbe together with Carl Zeiss published a paper in 1877 defining the physical laws that determined resolving distance of an objective. Known as Abbes Law,Abbe,Abbe & Zeiss,Abbe and Zeiss developed oil immersion systems by making oils that matched the refractive index of glass.
2、 Thus they were able to make the a Numeric Aperture (N.A.) to the maximum of 1.4 allowing light microscopes to resolve two points distanced only 0.2 microns apart (the theoretical maximum resolution of visible light microscopes).,Zeiss student microscope 1880,19世纪,高质量消色差浸液物镜的出现,使显微镜观察微细结构的能力大为提高。1827年阿米奇第一个采用了浸液物镜。,二、 显微镜的基本光学原理,Light Pathway of Microscope,三 光学显微镜的重要技术参数,在镜检时,人们总是希望能清晰而明亮的理想图象,这就需要显微镜的各项光学技术参数达到一定的标准,并且要求在使用时,必须根据镜检的目的和实际情况来协调各参数的关系。只有这样,才能充分发挥显微镜应有的性能,得到满意的镜检效果。 显微镜的光学技术参数包括:数值
3、孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好,它们之间是相互联系又相互制约的,在使用时,应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系,但应以保证分辨率为准。,1数值孔径,数值孔径简写NA,数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数,是判断两者(尤其对物镜而言)性能高低的重要标志。其数值的大小,分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。 数值孔径(NA)是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率(n)和孔径角( )半数的正弦之乘积。用公式表示如下:NA=n sin /2,孔径角又称“镜口角”,是物镜光轴上的物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大,进入物镜的光通亮就越大,它与物镜的有效直径成正比,与焦点的距离成反比。,Numerical Aperture,http:/micro.magnet.fsu.edu/,The wider the angle the lens is capable of receiving light at, the greater its resolving power The higher the NA, the shorter
4、 the working distance,显微镜观察时,若想增大NA值,孔径角是无法增大的,唯一的办法是增大介质的折射率n值。基于这一原理,就产生了水浸物镜和油浸物镜,因介质的折射率n值大于1,NA值就能大于1。,表一、几种介质的折射率,介质折射率越接近镜头玻璃的( 1. 7 )越好。 sin /2的最大值小于1;油镜介质为香柏油,镜口率可接近1.5。,2分辨率,显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距,又称“鉴别率“。其计算公式是 R=0.61/NA R为最小分辨距离; 为光线的波长; NA为物镜的数值孔径。 可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大,照明光线波长越短,则值越小,分辨率就越高。,http:/ depends on the Numerical Aperture,Resolving power. Sizes of cells and their components drawn on a logarithmic scale, indicating the range of objects that can be readi
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