浙大生物化学幻灯片15：dna的生物合成

1、生 物 化 学,浙江大学 生命科学学院 江 辉,第十五章 DNA的生物合成,第一节 半保留复制 第二节 DNA复制的酶学 第三节 DNA生物合成过程 第四节 DNA的损伤修复 第五节 逆转录现象和逆转录酶,有关DNA的两个问题,为什么大肠杆菌20分钟就可以繁殖一代，而生长最快的动物小母家鼠生长40天才成熟？ 为什么可通过DNA测序进行亲子鉴定？,中心法则,基因：是为生物活性产物编码的DNA功能片段，这些产物主要是蛋白质或是各种RNA。,DNA的生物合成（复制）,复制的要点 半保留复制 有起始点、终止点和方向 半不连续复制,第一节 半保留复制,当细胞分裂，DNA进行复制时，双螺旋结构解开而成为单链，用于合成新的互补链。子代细胞出现新的DNA双链，其中一股单链是从亲代完整地接受过来的旧链；另一股单链是完全重新合成的新链，且按碱基配对原则与旧链互补。,1、Watson和Crick的半保留复制模型,DNA双螺旋的两条链碱基通过A-T、G-C之间的氢键联结，并且两条链互补。因此，Watson和Crick提出DNA的半保留复制模型。 双螺旋揭开，每条链作为模板，以四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为底

2、物，在依赖于DNA的DNA聚合酶催化下，按照A-T、G-C配对方式，合成与两条模板链脱氧核苷酸对应的两条新链，然后以一新一旧脱氧多核苷酸组成的双链分别进入子细胞。,2、模型的试验证明,1958年Meselson和Stahl用密度梯度离心法结合同位素标记法进行证明试验： 1）将大肠杆菌在含标记的15NH4Cl的培养基内，繁殖12代，保证DNA上的N都是15N； 2）将上述培养好的细菌转入到含14NH4Cl的培养基中继续培养，并在细菌刚转入14NH4Cl中（0代）以及在此培养基中分裂1、2、3、4代时分别取样分析； 3）DNA用密度梯度平衡离心法进行高速长时间离心，由于15N-DNA的比重大于14N-DNA，在氯化铯溶液中离心时分别处在不同密度的层次中（重在下，轻在上）。,DNA半保留复制的实验证据,0代：两条单链全为重的（处于下层）； 1代：全部为一轻一重的杂合分子（处于上层和下层之间）； 2代：一种是15N-14N，与第1代的一样；另一种是全部轻的14N-14N。两者比为11； 3代：仍有两种分子，但14N-14N增多，两者比为13； 4代：两者比为17。,3、半保留复制意义,DNA在

3、代谢上的稳定保证了遗传信息的稳定性。,第二节 DNA复制的酶学,底物：dNTP（dATP，dGTP，dCTP，dTTP） 聚合酶：DNA依赖的DNA聚合酶（DNA-polymerase） 模板：单链的DNA母链 引物：寡核苷酸引物（RNA） 其他酶和蛋白质因子：拓扑异构酶、解螺旋酶、单链结合蛋白、DNA连接酶,DNA聚合酶的活性,5至3的聚合活性 5 3方向 核酸外切酶活性 5 3外切酶活性 3 5外切酶活性,一、复制的化学反应,5至3的聚合活性（ 5 3 ）,核酸外切酶活性,35外切酶活性 53外切酶活性,聚合反应,在DNA聚合酶催化下，四种脱氧核糖核苷三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）被加到DNA链的3末端，同时释放出无机焦磷酸。 1、DNA链的游离3-羟基对进入的dNTP磷原子发生亲核攻击，形成3,5-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。,2、形成磷酸二酯键的能量来自-与-磷酸基之间高能键的裂解。 3、聚合反应可逆，但随焦磷酸的水解可推动反应的完成。 4、DNA链由5向3方向延长。 5、需要有游离的3-羟基，即需要引物链。,DNA聚合反应特点,二、 DNA聚合酶,1、原核生物

4、： DNA聚合酶I（pol I）：与校对、修复有关 A、DNA聚合酶活力：通过核苷酸聚合反应使DNA链沿53方向延长； B、35核酸外切酶活力：由3端水解DNA链。在正常情况下该活力受抑制，一旦出现错配碱基时，聚合反应停止，该活力会切去错配碱基，起校对作用； C、53核酸外切酶活力：由5端水解DNA链。切除嘧啶二聚体和RNA引物。,pol I切除冈崎片段5端RNA引物 53核酸外切酶活力 DNA聚合酶活力,pol I的结构,单链多肽，用枯草杆菌蛋白酶进行有限水解，可得两个大小不同的片段。 小片段：53核酸外切酶活性； 大片段（Klenow片段）：聚合活性、35外切活性（常用工具酶）,DNA聚合酶II（pol II）：可能在DNA修复中起作用,以带有缺口的双链DNA为模板和引物，从53方向合成DNA，同时具有35外切酶活力。 多亚基聚合酶 含有DNA聚合酶活性和35核酸外切酶活性 不具有5 3核酸外切酶活性 反应需要NH4+ 激活 是一种主要起修复作用的酶。,DNA聚合酶III（pol III）：真正起复制作用的酶,由10种亚基组成的不对称二聚体，、组成核心酶。 活性：聚合活性、3 5外

5、切活性。 + + pol III（核心酶） pol III + pol III pol III + + pol III*（全酶） 具有聚合酶活力，具有校对功能，是组建核心酶因子，是二聚化因子，和是延长因子，识别引物并引导聚合酶结合，复制起始时被释放。 pol III只作用于有缺口的双链DNA，pol III可作用于有引物的长单链DNA，pol III*是天然的聚合酶。,pol III的结构,pol III-DNA结合示意图,大肠杆菌三种DNA聚合酶的比较,2、真核生物,DNA聚合酶：与随从链的合成有关。需要以缺口双链或带引物的单链DNA为模板，引物是DNA或RNA短链，RNA引物由引物合成酶合成 DNA聚合酶：核酸外切酶活性，与修复有关 DNA聚合酶：存在于线粒体。以RNA为模板，以DNA短链为引物 DNA聚合酶：与领头链的合成有关。具有3 5外切酶活力 DNA聚合酶：与校读、修复和填补缺口有关,3、复制的保真性,核酸外切酶活性和即时校读 pol I，pol II，pol III的亚基的3 5外切酶活性 复制的保真性和碱基选择 先形成氢键，再生成磷酸二酯键 依赖三种机理 遵守严格的碱基

6、互补配对规律 聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能 复制中出错时有即时校读功能,三、DNA拓扑学变化中的酶,1、DNA拓扑异构酶 类型I拓扑异构酶：催化DNA双链中的一条链的断裂和再连接，反应无需能量； 类型II拓扑异构酶：催化DNA双链的断裂和再连接，反应需消耗ATP； 原核生物中拓扑异构酶只能消除负超螺旋，真核生物中能消除正、负超螺旋。,2、解螺旋酶,领头链：rep蛋白沿模板链的3 5移动 随从链：解螺旋酶、Dna B沿模板链的5 3移动,3、单链DNA结合蛋白（SSB）,维持模板处于单链状态 保护单链的完整,四、引物酶和引发体,引物酶：RNA聚合酶 （Dna G） 引发体：Dna A辨认复制启始点，再结合Dna B、Dna C及其他复制因子形成复合体,、rep蛋白,五、DNA连接酶（ligase）,催化两段DNA之间的连接,NAD: 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 NMN: 烟酰胺单核苷酸,聚合酶,DNA连接酶,催化双链DNA切口处的5-磷酸基和3-羟基生成磷酸二酯键。 1）形成酶-AMP复合物 NAD+ + 连接酶 连接酶-AMP + NMN（细菌中） ATP + 连接酶 连接酶-AMP

7、+ PPi（动物中） 2）形成A-P-P-DNA 连接酶-AMP + 5-P-DNA A-P-P-DNA + 连接酶 形成了焦磷酸键 3）生成3,5-磷酸二酯键 DNA-OH-3 + A-P-P-DNA DNA-O-P-DNA + AMP 相邻链3-OH对活化的磷原子发生亲核攻击。,第三节 DNA生物合成过程,一、复制的起始 1、DNA解成单链：原核生物从一个固定的起始点开始，同时向两个方向进行的，称为双向复制复制,DNA复制叉的结构示意图,真核细胞染色体比较复杂，可能有多个复制起点，同时形成多个复制单位。 复制叉：复制开始后由于DNA双链解开，在两股单链上进行复制，形成在显微镜下可看到的叉状结构，称为复制叉。 E. coli复制起始点oriC跨度为245 bp，包含有三组串联重复序列和两对反向重复序列。,复制的起点,单个固定的起点：原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器DNA都是环状双链分子，具有单个固定的起点； 多个起点：真核生物染色体是线性双链分子，含有许多起点多复制子。,复制方向,直线双向式：单起点，双方向，有对称的和不对称的； 多起点双向式：真核生物染色体DNA的复制； 型

8、双、单向式：环状DNA的复制。有双向和单向（单向的形成一个复制叉，双向的形成两个复制叉），有对称和不对称（一个叉完成1/5，其余4/5由另一个叉完成）；,D-环式：单向复制。在固定点解开后一条链先复制，待复制到一定距离时，露出另一链的复制起点，才开始另一链的复制； 滚动环式：单向复制。共价闭环双链分子的正链由核酸内切酶在一特定位点切开，游离出的5-磷酸基末端固定在细胞膜上，然后以环状负链为模板，从正链的3-OH末端延长形成正链。,滚环复制,低等生物如质粒，复制时采用滚环复制。 环状DNA双链一股先开一个缺口，5端向外伸展。 两股链均直接作为模板，不需要另外合成引物。,2、引发体的生成,复制过程需要引物短链RNA 引物酶：合成RNA引物（十个nt左右），方向为5 3 DnaA辨认复制启始点，然后引物酶进入（DnaG蛋白），加上解螺旋酶、DnaB蛋白和DnaC蛋白等，与DNA的起始复制区域形成引发体。 DNA聚合酶III：由其亚基辨认引物，新链的第一个脱氧核苷酸与引物的3-OH形成磷酸二酯键，开始复制。 拓扑异构酶 ：松弛螺旋。,复制过程中各酶和蛋白质因子的作用,二、复制的延长,原核生物为

9、pol III 真核生物为DNA 聚合酶和，其中与随从链的合成有关，与领头链的合成有关 1、复制延长的生化过程 原核生物复制延长的速度很快 真核生物复制有多个复制起点,2、复制的半不连续性和冈崎片段,领头链是连续合成的，而随从链则是不连续合成 冈崎片段：冈崎用电子显微镜看到了DNA复制过程中出现一些不连续片段，这些不连续片段只存在于DNA复制叉上其中的一股。后来就把这些不连续的片段称为冈崎片段。,三、复制的终止,1、原核生物复制终止及不连续片段连接 复制有终止点ter 领头链是不间断延长的，随从链是 生成一个个的冈崎片段，最后连接成一条完整的DNA链。 pol I 5 3外切酶活性水解引物。 pol I聚合活性填补空隙。 DNA连接酶连接缺口。,滞后链RNA引物的切除: DNA聚合酶的53核酸外切酶活性,滞后链的连接,2、真核生物的端粒和端粒酶,端粒：是真核生物染色体线性DNA分子末端的结构 富含GC的重复序列 人：(TTAGGG)n 端粒酶：RNA-蛋白质复合物，既有模板，又有逆转录酶 以自身的RNA为模板延长DNA单链，然后反折为双链，爬行模式。 端粒酶与生物体的衰老、肿瘤的发生有关。,真核DNA的复制过程特征,真核生物染色体有核小体结构； 真核生物基因组庞大； 真核细胞染色体比较复杂，可能有多个复制起点，同时DNA上往往有多个复制子； 真核生物有DNA聚合酶和，其中与滞后链的合成有关，与领头链的合成有关； 真核生物DNA的复制子在每个细胞周期仅起始复制一次。,第四节 DNA的损伤修复,突变-DNA分子上碱基的改变 自发突变、人工诱变 一、突变的意义 突变是进化、分化的分子基础 只有基因型改变的突变 致死性的突变 突变是某些疾病的发病基础,二、引发突变的因素,三、突变分子改变的类型,错配（点突变） 一个碱基改变 缺失、插入和框移突变 片段插入或缺失 重排 较大片段重组或重排,

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