细胞工程幻灯片

1、1,细 胞 工 程 CELL ENGINEERING,改造和培养 细胞、组织、器官、个体的工程,刘广发,2,细胞工程主要内容（1）,细胞工程的基础知识与基本技术； 植物组织培养； 悬浮细胞培养和次生代谢物生产； 花药及单倍体植株培养； 原生质体制备与细胞融合； 人工种子制备； 植物脱病毒技术；,3,细胞工程主要内容（2）,动物细胞与组织培养 动物细胞融合 细胞重构与动物克隆 淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体 染色体转移与基因转移 人类干细胞研究 原核细胞的原生质体融合 真菌细胞的原生质体融合,4,参考文献,自编. 细胞工程讲义 罗立新等. 细胞工程. 华南理工大学出版社，2003 李志勇编著. 细胞工程. 科学出版社，2003,5,探究式自主学习计划,自愿组成学习小组，3人左右，选出组长； 每组选一个主题，时间约10 min； 各组需准备PowerPoint; 各组最高可得8分； 其他同学可提问、补充或更正； 教师讲评和讨论；,6,探究式自主学习安排（已选）,7,探究式自主学习安排（2）,8,细胞工程的三个层次,细胞水平：细胞培养, 细胞融合，整株培养； 细胞器水平：细胞核，染色体，各细胞器

2、； 基因水平：基因转化；,9,开展细胞工程的意义,研究各种细胞、组织和器官所需的生理条件及其特点； 有利于改变物种的遗传种性，加快选育优良品种的步伐； 可大量、不受季节限制地工厂化生产所需的组织或生物； 有利于某些药物、抗体及次生代谢物的生产； 可获得脱毒植物；,10,第一章 细胞工程发展简史,一. 植物细胞工程 1902 德国植物学家Harberlandt预言植物细胞具全能性； 1904 德国胚胎学家Hanning成功培养萝卜胚并长成植株； 1922 Robbins以豌豆等的茎尖在培养基上形成缺绿的叶和根； 1930-34 李继侗发现银杏胚乳提取物能促进银杏胚正常生长； 1934 美国White成功培养番茄离体根，发现愈靠根尖病毒愈少；,11,植物细胞工程,1935-36 中国罗宗洛父子发现嫩桑叶可促进玉米离体根生长； 1937 美国White发现Vit B促进离体根生长，指出IAA能调控生长； 1937 美国Michel首创用0.5M NaNO3融合两个植物细胞原生质体； 1941 Overbeek以椰子乳加入培养基，成功培养曼佗罗幼胚； ？ Skoog和崔澄发现腺嘌呤等能诱导芽生

3、成，指出腺嘌呤与生长素之比，比例高则生芽，比例低则生根；,12,植物细胞工程,1956 Miller发现激动素，证明其促芽能力是腺嘌呤的三万倍； 1958 Steward进行胡萝卜细胞悬浮培养，还长成胚状体和植株； 1953 Muir成功对烟草细胞进行悬浮液体培养； 1960 英国Cocking用纤维素酶制备番茄根细胞原生质体； 1964 印度Maheshwari以花药培养出单倍体组织； 1968 Reinhard用植物细胞悬浮培养生产出哈尔碱；,13,植物细胞工程,1972 Carlson用NaNO3成功融合不同烟草的原生质体； 1977 Kao（高国南）首创PEG- 高钙高pH值细胞融合法； 1978 Melchers获“番茄-马铃薯”杂种植物； 1985 Kitto研制出胡萝卜人工种子，美国、日本和法国相继开展 人工种子研制；,14,二. 动物细胞工程,1885 Wilhelm取出鸡胚髓板，在盐水中存活数天； 1903 Jolly将蝾螈的白细胞在悬滴中保存1个月； 1907 美国Harrison培养的蛙神经存活数周，且长出轴突； 1914 Tomson创立能在培养基中维持器官小块

4、的方法； ？ Carrel发现鸡胚浸出液明显促进细胞生长，使鸡胚心脏细胞传代3400次，生存34年，可无限生长；,15,动物细胞工程,1940 Earle建立可无限传代的小鼠结缔组织L系； 1951 Gay建立第一个永生人宫颈癌Hela细胞系； 1958 冈田善雄用灭活仙台病毒诱发腹水瘤细胞融合； 1960s 童第周和牛满江进行鱼和蛙的核移植，获核质杂种鱼；,16,动物细胞工程,1960 Barski成功进行小鼠细胞融合实验； 1965 Harris用灭活仙台病毒成功融合不同动物细胞； 1967 Weiss发现在人-鼠杂种细胞中，人染色体先丢失； 1975 Kohler & Milstein创立淋巴细胞杂交技术，获单克隆抗体； 1997 英国Willmut以体细胞成功克隆“Dolly”羊； 1998年，人类胚胎干细胞被首次培养成功； 1999年，日本医学家宣布，实现人肝细胞在体外增殖；,17,第二章 细胞工程的基础知识与基本技术,基础知识 1. 原核细胞：DNA裸露，生长迅速，易于操作；但具细胞壁，表达真核基因受一定限制。 2. 真核细胞：接近人类需要，但具细胞周期，要同步化培养；生长

5、慢，植物细胞和真菌细胞具细胞壁。,18,二.基本操作,无菌操作概念与技术 无菌室布局、卫生、消毒、超净台,19,基本操作,2.细胞培养 取样 灭菌 培养 传代 收获 除菌 取样 3. 细胞融合 原生质体 融合 筛选 4. 转基因细胞（个体）,20,第三章 植物细胞工程,植物组织培养； 悬浮细胞培养和次生代谢物生产； 花药及单倍体植株培养； 原生质体制备与细胞融合； 人工种子制备； 植物脱病毒技术；,主要内容：,21,第一节 植物组织培养,在无菌和人工控制营养及环境条件下研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长、发育的技术。 全世界通过植物细胞培养再生成植株已超过600种，已使许多具有重要经济价值的果树、药材、蔬菜和花卉等实现商品化生产。,22,植物组织培养过程,离体的植物器官、组织、细胞,脱分化,愈伤组织,再分化,芽 根,植物体,培养,23,植物组培基本过程,24,配MS培养基,1.基本组分：mg/L 蔗糖 3% , KNO3 1900, NH4NO3 1650, CaCl2 440, MgSO4 370, KH2PO4 170, 2.微量无机物：Na2EDTA 37.3, FeSO4

6、 27.8, MnSO4 22.3, ZnSO4 8.6, H3BO3 6.2, KI 0.83, Na2MoO4 0.25, CoCl2 0.025, CuSO4 0.025 3.微量有机物：mg /L 肌醇 100， 腺嘌呤 5， 甘氨酸 2，烟酸 0.5, 吡咯醇 0.5，硫胺素 0.1，生物素 0.01， 激动素(KT) 0.0410 吲哚乙酸（IAA） 130 4. Agar 10 g /L,预备阶段（1）,25,6-苄基腺嘌呤（6-BA）：先加少量0.1mol/L的NaOH和蒸馏水稍加热使其溶解； 萘乙酸（NAA）：先用少量95%乙醇和少量0.1mol/L的NaOH溶解；,26,不同植物的最适pH值,27,预备阶段（2）,选择合适的外植体 外植体大小要适宜； 外植体的部位影响其分化能力和器官分化的类型； 外植体的年龄影响其分化率； 同一植物不同部位的分化需不同的生长素/激动素比例； 不同物种的相同部位外植体分化能力不一样；,28,预备阶段（3）,除菌 自来水多次漂洗 消毒剂处理 无菌水反复冲洗 外植体 无菌滤纸吸干 切割,无菌外植体,若干块无菌外植体置培养基上,29,常用消

7、毒剂的使用和效果,消毒剂 使用浓度/% 清除 消毒时间/min 灭菌效果 次氯酸钠 2 容易 530 很好 次氯酸钙 910 容易 530 很好 漂白粉 饱和溶液 容易 530 很好 升汞 0.11 较难 210 最好 酒精 7075 容易 0.22 好 过氧化氢 1012 最容易 515 好 溴水 12 容易 210 很好 硝酸银 1 较难 530 好 抗生素 450 mg/L 中等 3060 较好,30,植物不同器官的消毒和处理,种子 纯酒精浸10 min，无菌水洗净，次氯酸钙（10）浸2030 min，无菌水洗35次，无菌滤纸吸干； ； 果实 纯酒精迅速漂洗，次氯酸钠（2）浸10 min，无菌水反复冲洗，剥除种子和内部组织； 茎切段 自来水洗净，纯酒精漂洗，次氯酸钠（2）浸1520 min，无菌水洗3次，无菌滤纸吸干； 叶片 自来水洗净，纯酒精漂洗，升汞（0.1）浸1min，或次氯酸钠（2）浸1520min，无菌水反复冲洗，无菌滤纸吸干；,31,诱导去分化形成愈伤组织,添加较高浓度的生长素； 固体培养； 液体培养； 光照培养； 黑暗培养；,32,形成愈伤组织所需的激素,只需生长素

8、类激素，如菊芋的块茎； 只需细胞分裂素激素，如芜菁根； 需上述两类激素，但有不同比例，多数植物； 还需复杂的天然提取物（椰子乳）等；,33,生长素类激素,吲哚乙酸（IAA）,常用110mg/L; 吲哚丁酸（IBA）,常用15 mg/L； 2，4-D（ 2，4-二氯苯氧乙酸），常用10-510-7 mol/L; 萘乙酸（NAA），常用1.0 mg/L；,34,细胞分裂素类激素,激动素（KT） 6-苄氨基嘌呤（6-BA） 玉米素,先加少量碱液预溶,35,继代增殖阶段,移植扩增； 分割继代；,36,光照培养室,37,生根长芽阶段,生长素与细胞分裂素对于细胞生长与分化具有协同作用，它们的量以及比例的不同配合，对细胞分化起着重要的作用； 外植体本身内源激素水平的差异，导致它们分化时对培养基中所添加的这两种激素量及其比例反应不尽相同；,38,长芽生根阶段,39,移栽成活阶段,保湿是关键； 避免强光直射； 温度适宜；,40,植物组培的优缺点,优点： A B C D 缺点： A B C,41,手指玫瑰,42,第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产,本方法的历史、现状 1956年，Routier 1981

9、年，Fujita等经培养生产出“紫草素”； 1991年，我国培养红豆杉细胞生产“紫杉醇”，达到60mg/L； 目前世界最大的细胞培养罐达20 t；,43,红豆杉合成的紫杉醇是著名的抗癌药物,44,细胞培养和原植物的天然产物量的比较,产 量 物 种 天然产物 细胞培养 原 植 物 橘叶鸡眼藤 蒽醌 900微克/克干重 110微克/克干重 决 明 蒽醌 鲜重的0.334% 种子干重的0.21% 长 春 花 蛇根碱 干重的1.3% 干重的0.26 % 三角叶薯蓣 薯蓣皂苷 26mg/克干重 20mg/克干块根 人 参 人参皂角苷 鲜重的0.38% 鲜重的0.33.3% 烟 草 烟碱 干重的3.4% 干重的25% 烟 草 泛醌 0.5mg/克干重 16mg/克干叶 大 红 罂 粟 蒂巴因 130mg/克干重 140mg/克干叶,45,从植物培养细胞中获得的各类物质,氨基酸 核酸 蛋白质 碳水化合物 脂类 维生素 有机酸 抗白血病药 抗肿瘤药 抗病毒药 抗微生物药 酶抑制剂 色素 香料 甜味剂 鸦片 杀虫剂 激素 强心苷 核苷酸 橡胶 阿司匹林 奎宁 可卡因,第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产,46,培养植物细胞制造疫苗,2006年2月，美国Dow AgroSciences公司完成了世界上第一个注册的植物制造疫苗； 将病原菌抗原决定基因转入植物基因组中，利用植物细胞而不是整株植物在一个安全的室内环境中

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