dna重组技术的基本工具1.ppt

1、选修3现代生物科技专题,2019/4/22,1,专题1 基因工程,2019/4/22,2,基础理论和技术的发展催生了基因工程,20世纪中叶，基础理论取得了重大突破 1.DNA是遗传物质的证明 2.DNA双螺旋结构和中心法则的确立 3.遗传密码的破译,2019/4/22,3,技术发明使基因工程的实施成为可能 1.基因转移载体的发现 2.工具酶的发现 3.DNA合成和测序技术的发明 4.DNA体外重组的实现 5.重组DNA表达实验的成功 6.第一例转基因动物问世 7.PCR技术的发明,2019/4/22,4,基因工程的概念：,基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。,2019/4/22,5,山西省孝义市第二中学,基因工程培育抗虫棉的简要过程：,普通棉花(无抗虫特性),苏云金芽孢杆菌,提取,抗虫基因,棉花细胞(含抗虫基因),棉花植株(有抗虫特性),重组DNA,导入,形成,2019/4/22,

2、6,山西省孝义市第二中学,1.1 DNA重组技术的基本工具,2019/4/22,7,山西省孝义市第二中学,基因工程需要哪些基本工具?,2019/4/22,8,山西省孝义市第二中学,培育抗虫棉需要哪些工具？,分子手术刀限制性核酸内切酶,分子缝合针DNA连接酶,分子运输车载体,2019/4/22,9,山西省孝义市第二中学,一、分子手术刀-限制性核酸内切酶(限制酶）,2019/4/22,10,山西省孝义市第二中学,2019/4/22,11,山西省孝义市第二中学,T,磷酸二酯键,A,2019/4/22,12,山西省孝义市第二中学,2019/4/22,13,山西省孝义市第二中学,内切酶切割DNA后形成的末端黏性末端、平末端是如何形成的？,2019/4/22,14,山西省孝义市第二中学,什么叫黏性末端？,2019/4/22,15,山西省孝义市第二中学,2019/4/22,16,山西省孝义市第二中学,什么叫平末端？,2019/4/22,17,山西省孝义市第二中学,大肠杆菌的一种限制酶（EcoR)能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开形成黏性末端。 Sma能识别CCCGGG序列，并在C和G之间切割

3、形成平末端 。,2019/4/22,18,山西省孝义市第二中学,当限制酶在它识别序列的中心轴线（图中虚线）两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。,2019/4/22,19,山西省孝义市第二中学,限制酶所识别的序列有什么特点？ 限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线,中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。 图1-1 限制酶识别序列的中心轴线,2019/4/22,20,山西省孝义市第二中学,识别双链DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。,主要是从原核生物中分离纯化出来的酶。,4000种。,1、来源：,2、种类：,3、作用：,4、结果：,形成两种末端,一、 “分子手术刀” 限制性核酸内切酶,2019/4/22,21,山西省孝义市第二中学,寻根问底:限制酶存在于原核细胞中的作用是什么？为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？,2019/4/22,22,山西省孝义市第二中学,怎样理解限制酶和DNA连接酶在微生物中能够分离到,而高

4、等植物和动物中没有?,2019/4/22,23,山西省孝义市第二中学,为什么限制酶不能将自己的DNA分子剪切掉？,1、DNA分子不具备该种限制酶的识别切割序列； 2、通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能切开。,2019/4/22,24,山西省孝义市第二中学,1.原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。,2.迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，

5、尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵.,2019/4/22,25,山西省孝义市第二中学,二、连接酶“分子缝合针”,.作用：连接磷酸二酯键,2019/4/22,26,山西省孝义市第二中学,限制酶切割后产生两种不同的末端。那么恢复它们的连接时，所用DNA连接酶是否可以不加选择？,E.coliDNA连接酶：连接黏性末端,T4DNA连接酶：连接黏性末端和平末端,.DNA连接酶的种类,2019/4/22,27,山西省孝义市第二中学,DNA连接酶-“分子缝合针”,分类,E.coliDNA连接酶,T4DNA连接酶,差别: E.coliDNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来,不能将双链DNA片段平末端之间进行连接; T4DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端,但连接平末端之间的效率比较低。,2019/4/22,28,山西省孝义市第二中学,DNA连接酶分子缝合针,2019/4/22,29,山西省孝义市第二中学,DNA聚合酶和DNA连接酶有何相同点和不同点？,2019/4/22,30,山西

6、省孝义市第二中学,答：不是一回事。DNA连接酶和DNA聚合酶都是形成磷酸二酯键（在相邻核苷酸的3位碳原子上的羟基与5位碳原子上所连磷酸基团的羟基之间形成），那么，二者的差别主要表现在什么地方呢？ （1）DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核酸片段的3末端的羟基上，形成磷酸二酯键；而DNA连接酶是在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键，不是在单个核苷酸与DNA片段之间形成磷酸二酯键。 （2）DNA聚合酶是以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键形成一条与模板链互补的DNA链；而DNA连接酶是将DNA双链上的两个缺口同时连接起来。因此DNA连接酶不需要模板。 此外，二者虽然都是由蛋白质构成的酶，但组成和性质各不相同。,2019/4/22,31,山西省孝义市第二中学,双链,单链,在两DNA片段之间形 成磷酸二酯键,将单个核苷酸加 到已存在的核酸 片段的3末端的 羟基上，形成磷 酸二酯键,都能形成磷酸二酯键 二者都由蛋白质构成,2019/4/22,32,山西省孝义市第二中学,假如目的基因导入受体细胞后不能复制将怎样？ 作为载体没有切割位点将怎样？ 目的基因是否进入受体细胞，你如何察觉？

7、如果载体对受体细胞有害将怎样？,三、基因进入受体细胞的载体 “分子运输车”,2019/4/22,33,山西省孝义市第二中学,载体的必要条件,能自我复制，或能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达； 有一个或多个切割位点 有标记基因位点，以便重组后进行筛选 对受体细胞无害。 大小适中，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。,2019/4/22,34,山西省孝义市第二中学,能复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别。,2019/4/22,35,山西省孝义市第二中学,常用的分子运输车有哪些？,质粒、 噬菌体衍生物、 动植物病毒,2019/4/22,36,山西省孝义市第二中学,2019/4/22,37,山西省孝义市第二中学,小结,对受体细胞无害,2019/4/22,38,山西省孝义市第二中学,思考与探究,总结规律,限制酶所识别的序列有什么特点？,无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称重复排列的。,1.限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开吗？以下是四种不同限制酶切割形成的DNA

8、片段： (1) CTGCA (2) AC (3) GC G TG CG（4）G (5) G (6) GC CTTAA ACGTC CG (7) GT (8)AATTC CA G 你是否能用DNA连接酶将它们连接起来？,2019/4/22,39,山西省孝义市第二中学,2和7能连接形成ACGT TGCA； 4和8能连接形成GAATTC CTTAAG； 3和6能连接形成GCGC CGCG； 1和5能连接形成CTGCAG GACGTC。,2019/4/22,40,山西省孝义市第二中学,3.基因工程中作为载体使用的DNA分子很多都是质粒（plasmid），即独立于细菌拟核处染色体DNA之外的一种可以自我复制、双链闭环的裸露的DNA分子。是否任何质粒都可以作为基因工程载体使用呢？其实不然，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。 （1） 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。 （2） 载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上

9、随染色体DNA的复制而同步复制。 （3） 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。 （4） 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 （5） 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。,2019/4/22,41,山西省孝义市第二中学,4.网上查询：DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？,迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。,2019/4/22,42,山西省孝义市第二中学,1.在基因工程中，切割运载体和含有目的基因的DNA片段，需使用（ ） 同种限制酶 B. 两种限制酶 同种连接酶 D. 两种连接酶,A,练习,2019/4/22,43,山西省孝义市第二中学,2.不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,2019/4/22,44,山西省孝义市第二中学,3. 基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A、目的基因的获取 B、基因表达载体的构建 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测与鉴定,C,练习,2019/4/22,45,山西省孝义市第二中学,谢谢,2019/4/22,46,山西省孝义市第二中学,问题:DNA聚合酶与DNA连接酶是同一种酶的不同名称吗?,2019/4/22,47,山西省孝义市第二中学,问题：标记基因的作用及其应用,标记基因,抗四环素的基因,抗氨苄青霉素的基因,特定颜色的基因,四环素,氨苄青霉素,2

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