dna重组技术的原理及步骤 ppt课件
26页1、DNA重组技术的原理及步骤,第五组:郑桂贤,一、发展历史,1951年,美国学者E莱德伯格等发现了噬菌体。1957年日本学者发现了抗药性质粒。 20世纪70年代初,生物化学研究的进展也为重组DNA技术奠定了基础 1978年,诺贝尔生医奖颁给发现DNA 限制酶的纳森斯、亚伯与史密斯时,斯吉巴尔斯基在基因期刊中写道:限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。 基因工程、遗传工程、分子克隆作为DNA重组技术的代名词被广泛使用。,二、DNA重组技术的原理,1.目的基因的获取 2.克隆载体的选择与构建 3.外源基因与载体的连接 4.重组DNA导入受体菌 5.重组体的筛选 6.克隆基因的表达,三、 DNA重组技术的步骤,1. 分:分离目的基因 2. 切:对目的基因和载体适当切割 3. 接:目的基因与载体连接 4. 转:重组DNA转入受体菌 5. 筛:筛选出含有重组体的受菌体,Recombinant DNA Technology,从细胞中分离出DNA,限制酶截取DNA片断,分离大肠杆菌中的质粒, DNA重组,用重组质粒转化大肠杆菌,培养大肠杆菌克隆大量基因,重组体的筛选,(一)分:目的基因的获取,1.
2、化学合成法:较短的基因(60-80bp)用途:PCR引物 、测序引物、 核酸杂交探针、定点突变 2. 基因组DNA 、cDNA 3. 聚合酶链反应,cDNA文库,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,基因组DNA文库,限制性内切酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,克隆载体的选择和构建,理想载体具备的条件:可转移性、复制功能、多克隆位点(广泛、特异)、显著的筛选标志,便于筛选和鉴定、安全性 常用克隆载体:质粒DNA、噬菌体DNA 、病毒DNA 质粒是存在于细菌染色体外的小型环状DNA分子;具有自我复制功能;带有抗性基因及表型识别等遗传性标记;经改造后具有多克隆位点。 pBR322是一个人工构建的重要质粒,有万能质粒之称。它是由pSF2124、pMB1及pSC101三个亲本质粒经复杂的重组过程构建而成的。,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,质粒载体,(二)切:对目的基因和载体适当切割,(1)与DNA分子相关的几种酶及基因工程的其他工具,限制性内切核酸酶,在特异位点上切割DNA分子 分三类,常用为类酶 识别序列呈回文对称,5- GAATTC
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