细胞因子表达举例
21页1、大肠杆菌分泌表达系统的构建,王富强,周兴军,王彦芳,田雪虹,张 谦,贺秉坤(华北制药集团新药研究开发中心,石家庄050015),大肠杆菌表达系统用于外源蛋白表达已经取得了令人瞩目的成果,是基因工程多肽药物生产的基础。建立自己的高效表达系统将极大地促进我们的研究及开发工作。,外源蛋白在大肠杆菌胞内表达,具有产量高、操作简便的优点。但许多外源蛋白在大肠杆菌中不能正确折叠,而是形成无活性不可溶的包涵体1。为获得高活性的功能蛋白,需要变性复性等一系列复杂操作,增加了工作难度和生产成本。,如果外源基因在大肠杆菌中表达形成可溶性,正确折叠,具有生物活性的蛋白,并分泌到培养基中,将为下游的纯化工作带来极大便利,有效提高生产效率。为此,我们构建了 大肠杆菌分泌表达载体,成功地将 蛋白分泌到培养基中。,1 材 料 1.1 质粒与菌株 18质粒购自.公司。质粒和克隆及表达宿主5和101由本中心保存。 1.2 工具酶及试剂 限制性内切酶、聚合酶、4连接酶购自公司。各种分子生物学试剂分别购自华美生物工程公司及北京天象人生物工程公司。所用 单抗购自公司。,2 方 法 2.1 寡核苷酸片段合成 根据文献报道2,设
2、计一对引物,由上海 公司合成。 上游引物1: 5 3, 带下划线处为识别位点; 下游引物2: 5 3。,2.2 扩增以 质粒为模板,利用设计的引物扩增出 序列。条件为:941,581,721,共30个循环。最后72延伸7。,2.3 分子克隆 质粒提取、酶切、片段回收、连接、转化等操作均按照等人的方法进行3。 2.4 序列测定采用双脱氧法测定。 2.5 重组蛋白的表达 分别转化大肠杆菌5和101,得到工程菌。工程菌的培养与表达参照文献4进行。,2.6 和免疫印迹分别按照文献3方法进行。培养液离心,上清经丙酮沉淀后上样电泳。另外,菌体重悬于用冰预冷的20%葡萄糖,20/ ,2 5/,8溶液中,冰浴10,13000离心, 沉淀用预冷的20/ 2 5/,8重悬,冰浴 10,13000离心,取上清电泳分析5。,2.7 重组蛋白活性测定 细胞活性测定采用60细胞株。采用公司的试剂盒,按说明书进行。,3 实验结果 3.1 表达载体的构建 以质粒18为背景6,构建 融合表达载体。在该系统中,外源基因表达由启动子与金黄色葡萄球菌蛋白启动子双重控制,有利于外源蛋白的分泌。信号肽选用金黄色葡萄球菌蛋白的信号
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