细菌的遗传与变异_7

1、第三章 细菌的生长和遗传变异,第一节 细菌的生长及其特性,细菌在适宜的环境条件下，不断吸收营养物质，按照自己的代谢方式进行新陈代谢活动。正常情况下，同化作用大于异化作用，细菌大量繁殖，数量增多的现象叫做生长。 这里的生长是细菌群体数量的增长。,细菌个体生长到一定阶段，就会以二分裂的方式形成二个子细胞，细菌个体数目增加，这种繁殖方式似乎与动植物的繁殖方式大不相同，但如果我们将细菌看作是一个植物的种子或动物的受精卵，把细菌繁殖产生的群体作为整体来考虑的话，细菌与其他生物则是完全相同的。细菌更像是一个“没有固定形状，没有组织分化，可分可合”的多细胞生物，更象是特殊植物，这里之所以说它是植物是因为只要给以合适的条件细菌也可以像植物一样永远生长下去。 各类细菌都是抱团群居，研究表明群居的细菌获得营养的能力大大高于游离的细菌，同时群居的细菌还象高等动植物一样释放类似激素的调节因子，使群体主动适应环境的变化，并对环境产生影响，因此研究单个细菌的生长意义不大，通常都是将细菌群体作为研究对象，考察细菌群体的生长规律，“生、老、病、死”。 在介绍细菌的生长规律之前，先介绍细菌生长数量的测定方法。,一、细菌

2、生长测定方法,（1）直接测定 直接测定是常用的细菌生长测定方法，它借助显微镜直接观察计数，其优点是测定过程快速，缺点是不能区分细菌的死活。直接测定法根据不同的测定方法原理，可以分成以下几类： 1.涂片染色法 将已知体积(001ml)的待测样品，均匀地涂布在载玻片的已知面积内(1cm2)，经固定染色后，在显微镜下选择若干个视野计算细胞的数量，每个视野的直径和面积、对应的细菌体积用目镜测微尺测出，结合视野中的细菌数量从而推算001ml菌样的细菌数量。,涂片染色法,2计数器测定法,将菌液滴在血球计数板01ml 的计数格中，细菌被固定染色后，在显微镜下选择数出若干个小格中的细菌数目，（一般数125个小格），根据比例关系折算出单位体积菌液中细菌的数量。,例如数了125个小格中有90个细菌则 (90125) 0.0025=288个/ml 菌液中细菌数目就为288个/ml。这种方法只能测定个体较大的细菌，细菌个体r若太小，则由于每一小格中细菌层层叠加，相互遮挡，难以准确计数。若适当稀释，效果较好。,3比例计数法,将待测样品溶液与等体积的血液混合，然后涂片，在显微镜下测定细菌与红血球数的比例，因血液中

3、的红血球数已知(男性400500万个ml，女性350450万个ml)，由此可以测得细菌数量。,4比浊计数法,这是测定悬浮细胞的快速方法。 其原理是细菌细胞是不完全透光的，光束通过悬浮液时会引起光的散射或吸收，降低透光度，在一定范围内透光度与溶液的混浊度即细胞浓度成正比，藉此可以测定细菌浓度。 采用这种方法时；为了得到实际的细胞绝对含量，通常须将已知细胞浓度的样品按上述测定程序制成标准曲线，然后根据透光度或光密度值从标准曲线中直接查得细菌含量。,（1）制标准曲线,（2）测定菌液浊度，查表得出细菌数量,（二）间接计数法,间接计数法又称活菌计数法。它是通过测定样品中活的细菌数量来间接地表示细菌的含量。这种方法优点在于只计数样品中的活细菌数目，缺点在于测定所需的时间较长，手续繁琐。它分下述几种方法：,1.平板计数法 将待测细菌样品先作10倍梯度稀释，然后取相应稀释度的样品涂布于固体平板培养基上，或与未经融化的固体培养基混合、摇匀，培养一定时间后观察并计数生长的菌数，最终根据细菌数和取样量计算出细菌浓度。,各取1ml，均匀涂布于固体培养基平板上,培养，每一个细菌会 生成一个菌落,稀释度过小，菌落

4、密集无法计数,可以计数，但数量过多，费时费力,数量合适，统计计算，作为结果,数量太少，误差因素太大，不做计数,一般计数平板的细菌生长菌落数以30300个为宜。 细菌数量=数出的菌落数/稀释度 例如：10-5稀释度时菌落数为100个 则 细菌数量=100/10-5=107个/mL 平板计数法是采用最广的一种活菌计数法。,2.液体计数法,液体计数法是根据统计学原理设计的一种方法。具体做法是：先将待测菌液作10倍梯度稀释，然后取相应稀释度的样品分别接种到3管或5管一组液体培养基中，培养一定时间后，观察各管及各组中细菌是否生长、记录结果，再查与之匹配的统计表，即最可能数表(MPN) ，算出细菌的最终含量。因此，这种方法又叫最可能数法或MPN法。,例如测定硫酸盐还原菌的数量，这种菌是厌氧菌，生长中形成了硫化氢气体，这些硫化氢会与铁生成大量黑色的硫化亚铁沉淀，在显微镜下这些沉淀很难与细菌区分；由于它是厌氧菌，不能在空气状态下生长，因此平板培养计数也无法使用，对这类菌可以利用它们生长时产生的硫化亚铁黑色特征进行液体培养，按MPN法进行计数。,（1）10倍梯度稀释,(3)统计、查表、计算,统计确定数量

5、指标 取生长的管数最多的且稀释度最高稀释度的生长管中生长的管数，为数量指标的第一位数字，后面两个稀释度的生长管数后两位数，就上例情况而言，3个重复生长的10-3和10-4两个稀释度，但两者中高稀释度的是10-4，其生长管数“3”为数量指标的第一位数字；第二和第三位数则为2和0。因此所得的数量指标为“320”。,查表 所查的统计表是通过其他精确的计数方法，确定的各种数量指标时细菌数量的可能的最大值，在确定了数量指标后，可从MPN三管法统计表查相应的细菌最大可能数量。,MPN三管法测数统计表,上面例子中数量指标“320” 对应的细菌最大可能数为9.5个菌/毫升。,杂质过多的污水不适宜用其他方法测定大肠杆菌，同样可以MPN法进行测定，除此之外，厌氧的铁细菌也只能用这种方法进行数量统计。,3.薄膜计数法,对于某些细菌含量较低的样品(如空气或饮用水)，可采用薄膜计数法。将待测样品通过带有许多小孔但又不让细菌透过的微孔滤膜，藉助膜的作用将细菌浓缩，再将膜放于固体培养基表面培养，然后类似于平板计数那样计算结果。这种计数法要求样品中不得含有过多的悬浮性固体或小颗粒。,（1）抽滤,（2）滤膜培养,（3）

6、统计计数 样品中的细菌数量=菌落数抽滤样品的体积数 例如 上图测出5个菌落，抽滤了100ml自来水 则 自来水中的细菌数=5100ml=50个/L自来水 上述各种活菌计数法中，根本原理都是利用一个细菌可以繁殖生成一个菌落的特点。因此被测的细菌都应处于均匀分散的悬浮状态。对于本身为絮体或颗粒状的细菌样品，如好氧水处理中的活性污泥，在测定计数之前要采取预处理方法(如匀浆器捣碎等)进行强化分散。,(三)重量法,细菌细胞尽管很微小，但是仍然具有一定的体积和重量，在细菌生长过程中，测定单位体积液体中细菌群体重量变化直接表示细菌生长数量的方法称为重量法。 1.测定细胞干重法 测定干重时，需先将细菌分离，再烘干称量。分离可采用离心法或过滤法。取已经培养一段时间的待测细菌样品，用离心机收集生长后的细菌细胞，或用滤纸、滤膜过滤截取生长后的细菌细胞，然后在105110下进行干燥，称取干燥后的重量，以此代表细菌生长量的多少。从细菌细胞的化学组分可知，干重约为湿重的1020。原核细菌的细胞重量是10-1510-11g/个细胞，真核单细胞微生物重量为10-1110-7g/个细胞。,水处理工程设施中的细菌生长量通

7、常采用这种细胞干重测定法。这种方法实际上测得的是水中悬浮物重量，它是将细菌作为所有悬浮物来进行测定，如果水中非细菌类的悬浮物很多的话，势必会严重干扰细菌计数的结果。 非细菌的悬浮物通常大部分是一些固体无机物及少量的油类等有机物，有机物与无机物在物理性质上有一个最大的区别，即在很高的温度下，有机物会被空气中的氧气彻底氧化为CO2和H2O，只留下非常少的残渣，而无机物化学性质稳定，高温下不会分解，这样我们可以利用高温灼烧的方法来区分细菌与固体无机物。,（1）悬浮物中绝大多数为细菌时,细胞数目=细菌群体的重量个体细菌的平均重量,（2）除细菌外还有大量无机悬浮物时,W1 W2 细菌群体的重量=W2W1 细胞数目=细菌群体的重量个体细菌的平均重量,（3）除细菌外还有大量有机悬浮物时,过多的有机物悬浮物会对测定结果干扰很大，此时不能用重量法，应改用其他方法。 总体来说重量法方法较之其他方法误差较大，一般只能作为粗率估计的计数方法。,2.细胞含氮量法,所有生物包括细菌细胞内的蛋白质氮含量比较稳定，一般在1516，平均为16。根据样品中属于有机来源的氮含量测定结果，就可以求出细菌生长量的多少。 这种方

8、法首先确定三项已知数，细菌中的蛋白质平均含量、水样中的氮来源、水样中的有机氮含量。 细菌中的蛋白质含量可以通过实验室纯细菌的分离破碎及氮含量测定来得出；水样中的氮来源可通过分析水的来源进行定性分析，如细菌培养液中起始的成分是无机氮化合物则水样中的有机氮都来源于细菌的蛋白质，这种情况下通过凯氏定氮测定出的有机氮含量就是细菌中的蛋白质含量，继而通过计算得出水中的细菌数量。 细菌的数目=有机氮含量16%单个细胞的蛋白质含量 如果水中非细菌的蛋白质比例过大，如屠宰厂废水及食品加工厂废水，这时细菌与游离蛋白质难以区分，这种方法不易参用。,3.DNA含量法,这种方法与细胞含氮量法思路是一样的，不同的细菌细胞DNA含量是不同的，但同种细菌的DNA含量却是基本一致。利用这一特性，可以通过测定DNA的含量来表示细菌的生长量，故可采用适当的荧光指示剂或染色剂与菌体DNA作用，用荧光比色或分光光度法测得DNA的含量。 这种方法对样品纯度以及仪器和人员的要求较高，通常只作为少量细菌纯培养时细菌数量的测定，条件合适时，这种方法的精确性是非常高的。,(四)其它生理生化指标法,细菌的生长生命活动过程中，不可避免地要

9、吸收和消耗一些物质，同时产生和分泌另一些物质。测定这些物质的变化与细菌数量的变化有着直接的关系，通过测定这类物质的变化可以间接表示细菌生长的情况。水处理中通常采用的生理生化指标有：营养物质(COD)的消耗，溶解氧的消耗(如好氧细菌的瓦呼仪测定法)，有机酸的产生，H2和CH4的产生(如厌氧细菌的生长及活性测定)。 利用这类方法时，首先要确定细菌的数量与这些物质变化的对应关系，作出相应的标准曲线。继而查表计算。,如好氧细菌，利用COD消耗速率与细菌数量的比例关系，由COD消耗情况判断细菌数量时，通常按如下方法进行 （1）测定COD消耗速率与细菌数量的标准曲线 分批细菌培养，固定时间取样测定培养条件下细菌数量与COD的值，作COD消耗速率与细菌数量的标准曲线 。,（2）应用,实际中我们只需要测定COD的消耗速率，对照标准曲线查相应的细菌数量，这类方法的准确性受细菌种类、标准测定情况与实际水环境情况的可比性等因素的影响，一般只用于实验室细菌生理研究使用。 以上细菌的各类测定方法各有长短，使用时应该根据具体情况加以选取。,二、细菌的生长特性,将细菌整个群体作为研究对象，来研究它们生长的特点就是我们这里所说的细菌生长特性，大体上可以分为两种情况，一种是间歇式培养（又叫分批式培养），另一种是连续式培养。一般通过测定细菌重量或数量随培养时间延续的曲线关系来考察细菌的生长特性。 1.间歇培养和生长曲线 通常情况实验室的细菌培养都采用细菌的间歇培养，这种培养只有开始时的一次投料和接种细菌，其余时间细菌根据环境变化自行生灭。这种培养方式主要用于细菌的生理特性研究。同时生物工程和废水生物处理中也有一些是以分批式反应器进行操作的。典型的细菌间歇式培养状态下细菌有下面一种共通的生长曲线特征。,（1）活细菌重量变化曲线,在培养的不同时间取一定体积菌液，通过死活细胞物理化学性质上的差别直接或间接的方法称量出活细胞的重量，得出单位体积菌液中活细胞重量与时间的变化曲线。在正常生长的情况，曲线关系如下图所示,生长速率上升阶段,细菌培养初期，营养物丰富，细菌同化作用旺盛，细菌数量呈级数增加，同时细菌开始在细胞内以糖原、油滴等形式储存营养物，细菌个

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