1、,选修三 现代生物科技专题,专题1、基因工程,一、基因工程的概念,指按照人们的愿望,进行严格的设计,并通过体外DNA重组和转基因等技术,赋予生物以新的遗传特性,从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,因此又叫做DNA重组技术。,基因工程,基因拼接技术,=,=,DNA重组技术,1.操作环境:_。 2.操作水平:_水平。 3.原理:_。 4.优点:克服_ _障碍,定向改 造生物_。 5.供体:提供_。 6.受体:表达目的基因。 7.本质:性状在_体内表达。,目的基因,体外,分子,基因重组,受体,远缘杂交不亲和,性状,记一记,对基因工程的概念的理解,1基因拼接的理论基础(从结构上分析,为什么不同生物的DNA能够重组?) (1)基因的本质是具遗传效应的DNA片段。 (2)DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸。 (3)双链DNA分子的空间结构都是双螺旋结构。,一、基因工程诞生的理论基础,2外源基因在受体内表达的理论基础 (1)基因是控制生物性状的独立遗传单位。 (2)遗传信息的传递都遵循中心法则。 (3)生物界共用一套遗传密码。,DN
2、A重组技术的基本工具,工欲善其事, 必先利其器.,想一想:获得转基因抗虫棉需要做哪些工作呢? 实现这一精确的操作过程的工具是什么呢?,1.1 DNA重组技术的基本工具,限制性核酸内切酶“分子手术刀” DNA连接酶“分子缝合针” 运载体“分子运输车”,识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。(6个,4、5、8个),主要是从原核生物中分离纯化出来的一种酶。,4000种。,(1)来源:,(2)种类:,(3)作用:,(4)结果:,形成两种末端,1、限制性核酸内切酶“分子手术刀”(小结),记一记,基因的剪刀限制性内切酶(简称限制酶),限制酶,实例:EcoR限制酶能专一识别GAATTC序列,并在G和A之间将这段序列切开。,要想获得某个目的基因必须要用限制酶切几个切点?,要切两个切点。,如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割,产生的黏性末端,相同还是不同。,相同,是不是把两者的黏性末端黏合起来,这样就真的合成 重组的DNA分子了?,实际还不够,还需要DNA连接酶进行连接。,思考题:,限制酶存在于原核生物中的作用是什么?,思考,原核生
3、物容易受到外源DNA的入侵 限制酶的作用:切割外源DNA,使之失效 保证自身的安全,限制酶为什么不会剪切原核生物本身的DNA?,思考,防御机制,1.同一原核细胞内有限制酶,但没切割序列,2.有酶且有切割序列, 但甲基化酶 的作用下 把甲基转移到碱基上, 让限制酶不能切割,2.“分子缝合针”DNA连接酶,(2)、分类,E.coliDNA连接酶,T4DNA连接酶,想一想:DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?,(1)、来源: (2)、作用:,(1)、来源: (2)、作用:,(1)、作用:,恢复被限制酶切开的两个核苷酸之 间的磷酸二酯键。,大肠杆菌 “缝合”黏性末端,T4噬菌体 “缝合”黏性末端和平末端,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,形成磷酸二酯键,都是蛋白质,以一条DNA链为模板。将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,不需要模板。 将DNA双链上的两个两个DNA片段连接起来。,以下是两种限制酶切割后形成的DNA片段,试分析: GC AATTC GC CTTAA CG G CG G,(1)其中和 是由一种限制酶切割形成的 末端,两者要重组成一个DNA 分子,所
4、用DNA连接酶通常是 。 (2) 和 是由另一种限制酶切割形成的_ 末端,两者要形成重组DNA片段,所用的连接酶通常是 。,反馈练习:,E.coliDNA连接酶,黏性,平,T4DNA连接酶,B,想一想:目的基因能直接在受体中表达吗?,3.基因的运输工具载体,质粒是独立于细菌拟核DNA之外能够自主复制的很小的双链环状DNA分子。,常用的载体?,质粒、噬菌体的衍生物和动植物病毒等。,什么是质粒?,作为载体的必要条件:,1、能自我复制或整合到受体染色体DNA上 随染色体DNA的复制而同步复制; 2、有一或多个限制酶的切割位点; 3、必须带有标记基因,供重组DNA的鉴定和选择 4、对受体细胞无毒害,记一记,载体的作用,相当于一种运输工具,将外源基因转移到受体细胞中去。,四个步骤:,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,1、2 基因工程的基本操作程序,一:目的基因的获取,1、目的基因主要是指 _也可以是一些具有调控作用的因子。,编码蛋白质的结构基因,3、常用方法:,人工合成法,反转录法,化学合成法,利用PCR技术扩增,从基因文库中获取,2、获得途径:,
5、从自然界已有物种中分离,人工方法合成,基因文库?,(1) 从基因文库中获取目的基因,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断,导入到受体菌的群体中,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,称为基因文库,cDNA文库的构建模式图,杂交双链 (单链RNA/单链DNA),单链DNA,反转录酶,双链DNA (cDNA),某种生物的mRNA,核酸酶H,DNA聚合酶,与载体连接后导入受体菌贮存,组成cDNA文库,基因组文库与cDNA文库的比较P10表,小,大,有,无,有,无,某种生物的全部基因,某种生物的部分基因,部分基因可以,可以,(2)利用PCR技术扩增目的基因,1、定义:PCR多聚酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 通过此技术,可获取大量的目的基因。,DNA双链复制,2、原理:,3、条件:,4、过程:,5、方式:,一段已知目的基因的核苷酸序列,模板DNA;DNA引物;四种脱氧核苷酸;热稳定DNA聚合酶(Taq酶)能量,以_方式扩增, 即_(n为扩增循环的次数),指数,2n,6、仪器:,PCR扩增仪,PCR技术扩增与DNA复制的比较,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能
6、量、酶,高温下变性解旋,解旋酶催化,体外复制(PCR扩增仪内),主要在细胞核内,热稳定的DNA聚合酶(Taq酶),大量的DNA片段,形成整个DNA分子,解旋酶、 普通的DNA聚合酶等,(3)人工合成,反转录法:,目的基因的mRNA,杂交双链 (单链RNA/单链DNA),单链DNA,反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA (目的基因),根据已知的氨基酸序列合成DNA法 :,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的脱氧核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,二、基因表达载体的构建核心,(1)用一定的_切割质粒,使其出现一个切口,露出_。 (2)用_ _切断目 的基因,使其产生_ _。,(3)将切下的目的基因片段插入质粒的_处,再加入适量_,形成了一个重组DNA分子(重组质粒),限制酶,黏性末端,同一种限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA连接酶,1.过程:,目的基因,同一种限制酶,T4 DNA连接酶 15C,目的基因 自连,目的基因与运载体结合,3.基因表达载体的组成:,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是mRNA识别并结合位点。,位于基因的末端,终
7、止转录。,检测受体细胞中是否有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,2、基因表达载体的作用,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,三、将目的基因导入受体细胞,目的基因进入_ _内,并且在受体细胞内维持_ _和_ _的过程。,转化:,受体细胞,稳定,表达,1、导入植物细胞:,2、导入动物细胞:,3、导入微生物细胞:,常用方法:,农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞法(或Ca2+转化法),1、将目的基因导入植物细胞,(1)农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒 目的基因,构建,表达载体,导入,植物细胞,插入,植物细胞染色DNA,表达,新性状,转入,农杆菌,适用双子叶、裸子植物,(2)基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法,是利用压缩气体产生的动力,将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中,使目的基因与其整合并表达的方法。,适用于单子叶植物,(3)花粉通道法,花粉管通道法就是在植物受粉后,花粉形成的花粉
8、管还未愈合前,剪去柱头,然后,滴加DNA(含目的基因),使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,2、将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,常用受体细胞:,受精卵,3、将目的基因导入微生物细胞,Ca2+处理,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程:,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,(用Ca2+处理,增加细菌细胞壁的通透性),处于能吸收周围环境中DNA分子的生理状态的细胞,常用法:,常用受体细胞:,微生物作受体细胞原因:,(1)_目的基因的有无 (2)分子杂交技术_ (3)_目的基因是否翻译 (4)生物性状的表达与否目的基因是否表达 (个体水平),DNA分子杂交技术,目的基因是否转录,抗原抗体杂交,分子水平,四、目的基因的检测与鉴定,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,1、导入检测,目的:,方法:,DNA分子杂交技术,过程:,.首先取出转基因生物的基因组DNA .将含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作标记,以此做
9、探针。 使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中,四、目的基因的检测与鉴定,从转基因生物中提取的基因组DNA,探针:,杂交的对象:,用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段,15N,15N,14N,探针,转基因生 物的DNA,变性,变性,14N,2、转录检测,目的:,检测目的基因是否转录出了mRNA,方法:,分子杂交技术,用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段,探针:,杂交的对象:,从转基因生物中提取的mRNA.,3、翻译检测,目的:,检测目的基因是否翻译成蛋白质,方法:,抗原抗体杂交技术,从转基因生物中提取的蛋白质,抗原:,抗体:,将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进行免疫产生的相应抗体,4、个体生物学水平的鉴定,抗虫或抗病鉴定、 活性鉴定等,1.转基因植物,杀虫的基因主要有Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等,抗病毒基因:病毒外壳蛋白基因和病毒的复制酶基因; 抗真菌基因:几丁质酶基因和抗毒素合成基因,抗盐碱和抗干旱的调节细胞渗透压基因、 抗冻蛋白基因、抗除草剂基因,转基因玉米中赖氨酸的含量比对照提高30% 转基因延熟番茄储存时间可延长12个月 转基因矮牵牛呈现出自然界没有的颜色变异,1、3 基因工程的应用,2.转基因动物,如转外源生长激素基因绵羊和转外源生长激素基因鲤鱼生长速率快、体型大,如将肠乳糖酶基因导入奶牛基因组,使获得的转基因牛分泌的乳汁中,乳糖的含量大大减低,而其他营养
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