医学免疫学检验-免疫荧光技术课件
37页1、荧光免疫技术 fluoroimmunoassay,免疫荧光技术(Immunofluorescence technique )又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。 免疫荧光技术包括荧光抗体技术和荧光抗原技术,因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合,用于检测或定位各种抗原,也可以与其他蛋白质结合,用于检测或定位抗体,但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用,所以人们习惯称为荧光抗体技术,或称为免疫荧光技术。,该技术的主要优缺点 主要优点:特异性强、敏感性高、速度快。 主要缺点:非特异性染色问题尚未完全解 决,结果判定的客观性不足, 技术程序也还比较复杂。,基本原理 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。,以荧光素作为标记物,与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂,用于检测和鉴定未知的抗原。 在荧光显微镜下,可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。在实际工作中,由于用荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用,所以一般通称为荧光抗体技术。,第一节 荧光的基本知识 一、 荧
2、光 荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后,即刻引起发光;停止能量供给,发光亦瞬即停止。荧光素是一种可吸收激发光的光便能产生荧光,并能作为染料使用的有机化合物,亦称荧光色素。,二、荧光技术中有关的概念和参数 发射光谱 指固定激发波长,在不同波长下所记录到的样品发射荧光的相对强度。 激发光谱 指固定检测发射波长,用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。 荧光效率 指荧光物质将吸收的光能转变成为荧光的百分率。 荧光效率=,发射激光的光量子数(荧光强度),吸收光的光量子数(激发光强度),4 荧光寿命 指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰退到一定程度所用的时间。,荧光的猝灭 指荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会发生减弱的现象。 荧光偏振 P=,FH-FL,FH-FL,P:偏振度; FH:表示激发光起偏器和荧光检偏器的透射轴方向平行时测得的荧光强度; FL:表示以上两者方向相互垂直时测得的荧光强度。,P=0,完全不偏振 P(-1,+1),部分偏振,三、荧光物质 1 荧光色素 能够产生明显荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于
3、标记抗体的荧光色素,必须具有化学上的活性基因,能与蛋白质稳定结合,且不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。,荧光色素的标记 目前适于标记蛋白的荧光色素主要有: 异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC) 四乙基罗丹明(rho-damine B200,RB200) 四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rhodamine isotheynate,TMRITC) 藻红蛋白(R-RE) 实际上目前应用最多的只有异硫氰酸荧光素一种。,(1) FITC标记 FITC为黄色结晶形粉末,分子量为389.4,易溶于水和酒精等溶剂中,溶解后呈黄绿色荧光,最大吸收光谱为490-495nm,FITC的溶液不稳定,易因水解或迭聚而变质,故需在配好后2h内应用。 FITC含有异硫氰基,在碱性条件下能与IgG的自由氨基(主要是赖氨酸的-氨基)结合,形成荧光抗体结合物。一个分子的IgG有86个赖氨酸残基,但一般最多只能标记15-20个。,异硫氰酸荧光素(FITC),(2) RB200标记 本品为无定形褐红色粉末,不溶于水,易溶于酒精和丙酮,性质稳定,可长期保
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