生物化学王镜岩第三版第八章-蛋白质理化性质课件

1、蛋白质的理化性质和分离纯化,第八章,蛋白质的理化性质,蛋白质分子量的确定方法,化学组成： 最低相对分子量=（某元素的原子量/某元素的百分含量）*100,蛋白质的性质,（一）蛋白质的相对分子量,蛋白质相对分子量在6 0001 000 000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳 等。,蛋白质的性质,最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在2550*104 g离心力作用下从溶液中沉降下来。,沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。,v =沉降速度（dx/dt） =离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）,沉降系数的单位常用S，1S=110-13（s）,蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系,（二） 胶体的概念,分散体系，分散相质点直径1-100nm间,布朗运动,不能通过半透膜,丁达尔现象,丁达尔现象,聚光光束通过放在暗处的溶胶时，侧面可见明亮的光柱,不透过半透膜透析,布朗运动,悬浮在气体或液体中的微粒作永不停止的、无秩序的运动,分散相质点,合力方向,分散介质粒子,分散介质

2、对分散质点的冲击,酸,碱,蛋白质稳定的因素,碱,碱,酸,+ + + + + +,+ +,+ +,正电荷 的蛋白质,等电点 的蛋白质,负电荷 的蛋白质,- - - -,- - -,- - -,分散相质点带有同种电荷 分散相质点与溶剂形成溶剂化层,蛋白质分子相互聚集从胶体溶液中析出的现象称为沉淀。,蛋白质的沉淀作用,蛋白质沉淀的原理,甲醇,乙醇,丙酮,沉淀 反应因素,高浓度盐,有机溶剂,重金 属盐,某些 酸类,加热,1 高浓度盐类（盐析）,分段盐析：调节盐浓度，使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分别析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。一般不引起变性,NaCl,给溶液中加NaCl,争夺水分子，破坏水化层,中和电荷，削弱静电斥力,蛋白质电荷数和亲水性差 异，沉淀所需盐浓度不同,2 有机溶剂,必须低温操作和沉淀后快速水(或缓冲液)溶解，降低有机溶剂浓度,防止蛋白质变性,加甲醇、乙醇、丙酮等,争夺水分子，破坏水化层,降低溶液的介电常数，增加质点间相互作用,当溶液pHpI,蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子(Hg2+,Pb2+, Ag+等)生成不溶性沉淀

3、。,3 重金属盐,重金属中毒,4 某些酸类,当溶液pHpI时,蛋白质颗粒带正电荷,加入磺基水杨酸、三氯醋酸、过氯酸以及硝酸等，其酸根负离子可以与蛋白质化合成不溶性盐类而沉淀,5 加热,加热变性使蛋白质天然结构解体，疏水基外露，损坏了水化层。,极性部分,非极性部分,疏水区,卤水（MgCl2) 石膏(CaSO4),豆浆,豆腐,蛋白质的理化性质,蛋白质溶液是一种胶体溶液； 特定的空间构象，分子量一定 分子筛层析； 在大部分pH条件下，蛋白质分子同时存在两种电荷 等电点沉淀，盐溶，盐析，电泳，离子交换层析等； 一般而言，蛋白质分子上同时存在疏水和亲水区域 有机溶剂沉淀.,蛋白质的理化性质,蛋白质的分离纯化,蛋白质分离纯化的基本原则,选择好的材料 摸清目的蛋白质的稳定性 探索有效的抽提法和浓缩法 建立一套层析的组合 以较好的方法贮存,蛋白质分离纯化的几个基本原则,初提 精纯化 盐析 离子交换层析 有机溶剂沉淀 分子筛层析 等电点沉淀 疏水/反相层析 结晶 亲和层析,蛋白质分离纯化的具体方法,蛋白质分离纯化的具体方法,疏水区域,蛋白质分子上的电荷与疏水区,蛋白质分子上的电荷与疏水区,蛋白质在等电点

4、的 溶解度最小,pH与盐浓度对蛋白质溶解度的共同作用,蛋白质的盐析,硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响,离子强度,盐 析,盐溶,蛋白质的盐析,电泳,电泳：带电粒子在直流电场中向着电性相反电极移动的现象。,pH pI, 样品带负电荷，样品点向阳极移动,1708年Reuss的实验,1930年Tiselius的装置,最早的电泳装置,最早的电泳装置,1948年分离血清蛋白的工作获得诺贝尔化学奖,几种常用的电泳,等电聚焦 纸电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 OFarrell的双向电泳,几种常用的电泳,电泳：,1. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。,2. 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。,（1）纸上电泳：用滤纸作支持物。,（2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。,1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。,2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。,等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。,通电,OFarrell的蛋白质双向电泳,银染结果,考马斯亮染色为蓝色,OFarrell的蛋白质

5、双向电泳,什么是层析-chromatography,蛋白质分离纯化中常用的层析,分子筛层析 亲和层析 离子交换层析 疏水/反相层析 物理吸附层析,层析的种类,利用分子量差异,利用电荷差异,利用亲疏性差异,利用特异性亲和,利用非特异性吸附,分子筛层析的工作原理,分子筛层析的工作原理,分子筛层析，Molecular-sieve chromatography; 凝胶过滤: Gel filtration chromato-graphy; 或 Gel retar-dation chromatography.,http:/ Mr=RTs/(1-)D 凝胶过滤: lgMr=a/b-(1/b)( ve/ v0) SDSPAGE法: lgMr=a-bR 扩散法: 渗透压法: Mr=RT/lim/c 根据化学组成： 最低相对分子量=（元素的原子量/某元素的百分含量）*100,复旦大学生物化学系,黄伟达,蛋白质的定量法,凯氏(Kjeldahl)定氮法: 浓硫酸加热降解蛋白质后测定NH3 双缩脲(biuret)法: CuSO4与肽链的氨基结合 Folin-Phenol法: 芳香族氨基酸侧链发色 BCA (bi

6、cinchoninic acid)法: FDA唯一认可 紫外法: 280纳米处的紫外吸收 (1 OD280 = 1 mg/ml) Bradford法: 考马斯亮兰 ( Coomassie brilliant blue G250)与肽链结合后吸收谱变化,蛋白质的定量法,蛋白质的定量法,凯氏(Kjeldahl)定氮法: 浓硫酸加热降解蛋白质后测定NH3 含氮的有机物与浓硫酸共热时，其中的碳、氢2元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。,蛋白质的定量法,复旦大学生物化学系,黄伟达,蛋白质的定量法,凯氏(Kjeldahl)定氮法: 甘氨酸的消化过程可表示如下： CH2NH2COOH+3H2SO4一2CO2+3SO2十4H2O十NH3 2NH3+H2SO4一(NH4)2SO4 浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴

7、定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数(相当于待测物中氨的摩尔数)计算出待测物中的总氮量。,蛋白质的定量法,蛋白质的定量法,双缩脲(biuret)法: CuSO4与肽链的氨基结合 蛋白质分子中的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物，在540nm波长有特定吸收峰，所产生的颜色深浅与蛋白质浓度成正比，依此原理可测蛋白质含量。由于此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与铜离子作用生成紫红色的反应相似，故称双缩脲反应。,蛋白质的定量法,蛋白质的定量法,Folin-Phenol法: 芳香族氨基酸侧链发色 此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深蓝色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。 Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比。 Folin酚试剂法最早由Lowry确定了蛋

8、白质浓度测定的基本步骤。,蛋白质的定量法,蛋白质的定量法,BCA (bicinchoninic acid)法: FDA唯一认可 二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子和独特的BCA Solution A（含有BCA）相互作用产生敏感的颜色反应。两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度。,蛋白质的定量法,蛋白质的定量法,紫外法: 280纳米处的紫外吸收 (1 OD280 = 1 mg/ml) 蛋白质分子中所含酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质在280nm波长处有最大吸收值。在一定浓度范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量成正比关系，可用作定量测定。紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，广泛应用在柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测。 此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差； （2）若样品中核酸等吸收紫外线

9、的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但是可作为初步定量的依据。该法可测定蛋白范围应在0.11.0mg /mL。,蛋白质的定量法,复旦大学生物化学系,黄伟达,蛋白质的定量法,Bradford法: 考马斯亮兰 ( Coomassie brilliant blue G250)与肽链结合后吸收谱变化 这一方法基于考马斯亮蓝G-250有红蓝两种不同的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。反应化合物在595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量。,蛋白质的定量法,蛋白质紫外吸收定量计算,光吸收值 A 的Beer-Lambert公式: A = kcl = log (Io/I) = -log T, T (透过率,%) = I / Io ; k, 消光系数; c, 摩尔浓度; l, 样品池长度; I, 光强度 对混合蛋白质样品, 1 OD280nm 1 mg/ml 对特定蛋白质的光吸收值的理论值: A280(1 mg/mL) = (5690Nw + 1280Ny + 120 Nc)/M Nw,Ny和Nc分别为Trp,Tyr和Cys的数量, M为分子量; Scopes

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