医学免疫学检验-免疫细胞的分离和检测课件
58页1、第十三章 免疫细胞分离及检测技术Separation and Assays for Immunocyte,目的要求,掌握免疫细胞分离与纯化的方法;淋巴细胞、吞噬细胞的功能检测的方法。熟悉淋巴细胞数量检测的方法与原理。,教学内容,1. 免疫细胞的分离与纯化,2. 淋巴细胞的数量检测,3. 淋巴细胞的功能检测,4. 吞噬细胞的功能检测,第一节 免疫细胞的分离与纯化Separation and Purification of Immunocyte,实验的目的;,所需细胞的种类、纯度和数量;,方法简便可行,尽量保持活性、 纯度和收获率。,一、白细胞的分离,(一)自然沉降法,利用血细胞自然沉降率的分离方法。,(二)聚合物加速沉降法,某些高分子聚合物(如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等)可使红细胞凝聚成串,加速红细胞沉降,使之更易与白细胞分离。,(二)聚合物加速沉降法,某些高分子聚合物(如明胶、右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮等)可使红细胞凝聚成串,加速红细胞沉降,使之更易与白细胞分离。,二、外周血单个核细胞分离,外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuc
2、lear cell),主要指淋巴细胞和单核细胞,是免疫学实验中最常用的细胞群。密度为1.0751.090 。,分离液的基本要求,对细胞无毒,基本等渗,不溶于血浆或分离物质,有一定密度,密度梯度离心法 (density gradient centrifudation),Ficoll(商品名) 成份:2份6%聚蔗糖(ficoll)水溶液 + 1份34%泛影葡胺(hypaque)生理盐水溶液。 最常用的方法,分离纯度可达95%,细胞获取率80% 。试验尽量在低温下进行(4 8 或冰浴)。,密度梯度分离单个核细胞(Ficoll分层液),密度梯度分离单个核细胞(Ficoll分层液),Percoll (商品名) 经过聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrolidone,PVP)处理的硅胶颗粒大小不一的混悬液。 高速离心后,形成连续密度梯度,可将密度不同的细胞分离纯化。分离淋巴细胞纯度达98% ,单个核细胞纯度达78% 。流程长、烦琐、费用高。,密度梯度分离单个核细胞( Percoll分层液),三、淋巴细胞的分离与纯化,(一)红细胞的去除 无菌蒸馏水低渗裂解法或0.83%氯化铵处理法。,(二)血
3、小板的去除 离心洗涤23次。,PBMC悬液富含淋巴细胞,但有混杂有单核细胞、红细胞和血小板。,(三) 单核细胞和粒细胞的去除,黏附法 利用二者具黏附玻璃、塑料和葡聚糖凝胶(Sephhadex G-10)等特性。95%为淋巴细胞,活性大于95% 。但损失部分B淋巴细胞。,2.磁铁吸引法 PBMC吞噬直径3um的羰基铁颗粒,用磁铁将细胞吸至管底,上清即含较纯的淋巴细胞。,3. Percoll分层液法,密度梯度分离单个核细胞( Percoll分层液),四、T细胞和B细胞的分离,(一)E花环沉降法 成熟T细胞表面有SRBC受体(E受体),可和SRBC形成E花环,B细胞则无。但可活化T细胞。,E花环(电子显微镜),(二)EA花环,B细胞表面带有IgG Fc段受体,AgAb复合物中IgG Fc段牢固结合;这类红细胞抗体致敏的动物红细胞(EA)黏附在B细胞周围形成花环。,(三)尼龙毛柱分离法,利用B细胞和单核细胞具有黏附在尼龙(nylon wool) 表面的特性。 先洗脱出的事T细胞,再用培养也便冲洗边捻压塑料管,流出来的液体中主要含B细胞。T细胞纯度达90%,B细胞纯度达80% 。,四、细胞亚群的
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