微孔板检测技术的原理和应用

1、微孔板检测技术的原理和应用,张智彧 应用工程师,原理及应用介绍大纲,光的物理简介 光吸收检测的原理与应用实例 荧光检测的原理与应用实例 发光检测的原理与应用实例,光的物理简介,光的本质 光的性质,光的本质,一种能量 电磁波 电子能级（轨道） 波粒二相性 衍射 光电效应,红外线,光的性质,基本性质 速度：3108m/s 波长：颜色 频率：能量E = h 其他性质 偏振 荧光：激发,c = ,光的性质,物体的颜色 白光是复合光 单色光 互补色光 溶液的颜色 由溶液中的质点（分子，离子）吸收特定波长的光，透射其互补色的光 吸收曲线,KMnO4溶液的吸收曲线 (cKMnO4: abcd),原理及应用介绍大纲,光的物理简介 光吸收检测的原理与应用实例 荧光检测的原理与应用实例 发光检测的原理与应用实例,光吸收检测的原理,当光穿过待测物时，光的强度（能量）发生变化,（公式反应了与浓度的依赖关系） I0 入射光强度 I 透射光强度 摩尔消光系数 b 光程 c 样品浓度,吸光值(Absorbance)的意义,影响结果的因素,单色光不纯 非平行入射光 介质不均匀 溶液浓度过高 溶液中发生化学反应,光吸收

2、的应用,如果光的强度变化能够反映被测量物的待测性质，则显色反应都可以使用光吸收 核酸和蛋白质的紫外光吸收检测 酶联免疫检测（ELISA） 酶动力学分析 细菌内毒素检测 乙酰胆碱脂酶检测 细胞活性检测（MTT） 环境监测,核酸的紫外光吸收检测,DNA，RNA的吸收峰在260nm 标准曲线法 光程测量法（光程未知【酶标板】） 校正吸收值到1cm光程 通过水（如果溶剂是水）的1cm光程吸收值来校正,标准曲线法,作光吸收最常用的方法 已知浓度样品 吸收值（同一光程【比色杯】） 标准曲线 未知吸收值带入，得到未知样品浓度,光程测量法,光程不一致时（酶标板） 通过水的吸收值（1cm光程）来求得实际光程 水在977nm有吸收峰，在900nm几乎无吸收（与溶质的吸收峰无重叠） Pathlength：实际的光程,A977：水溶液样品在977nm的吸光值 A900：水溶液样品本底 Awatercm-1：1cm光程比色杯中水的吸光度值（ A977 ）本底值（ A900 ）,光程测量法,水相样品的吸收值/cm光程： 光程的校正 水：998nm等消光点（受温度影响小） 977nm吸收峰,Asample：样品在特

3、定波长的吸光值,实例：DNA浓度的测量,水的吸光度/cm Result: Awater: A998 A900: 0.159 OD/cm 样品的吸光度 A998 A900: 0.132 OD A260: 0.084 OD,实例：DNA浓度的测量,光程的校正 DNA的分光光度计标准，1 OD/cm 相当于50ng/ul DNA 相当于40ng/ul RNA 相当于33ng/ul Oligo 结果计算：0.10150ng/ul=5.05ng/ul,实例：蛋白定量,Coomassie Brilliant Blue G-250,加入蛋白质,酸性环境下呈茶色,与蛋白质结合变蓝色,CBG 是一种指示剂,470 nm,595 nm,实例：ELISA,抗原，抗体，底物，显色反应 阴性域值，阳性程度，定量,实例：细胞活性检测（MTT）,细胞代谢活动与活细胞数直接成比例（线粒体的活性脱氢酶的活性） MTT： 一种甲氮唑盐，是细胞线粒体脱氢酶的底物；活 细胞内的线粒体脱氢酶可将MTT分解产生蓝黑色（fromazan）产物 进入活细胞，被分解，裂解细胞，分析吸光度,Fromazan吸光谱,实例：细胞活性检测（M

4、TT）,实例：内毒素检测（LPS）,LPS：存在于革兰阴性(G)细菌细胞壁外层，脂多糖，为细菌类属的共同抗原，介导多种生物效应。可作为多种与G细菌相关疾病的诊断和预后指标 方法：鲎血细胞基质染色试验 原理：LPS作用于鲎血细胞溶解物中的凝固酶原使之成为凝固酶。凝固酶水解人工底物显色。（检测波长：405nm ）,实例：乙酰胆碱脂酶检测,乙酰胆碱酯酶（AChE）：可作为反映胎儿神经系统成熟度的指标。 方法：乙酰胆碱酯酶水解乙酰胆碱生成胆碱及乙酸，胆碱可以与巯基显色剂反应生成TNB黄色化合物。（检测波长：450nm）,光吸收的优势和缺点,优势 技术成熟 设备和试剂成本低 操作简单,光吸收的优势和缺点,缺点 动态范围窄 灵敏度低（核酸到ng级） 特异性不强 受溶液的浓度和粘稠度影响 细胞学实验中采用的吸收底物往往有细胞毒性 相互作用检测很难实现实时检测 无法做多标记检测,原理及应用介绍大纲,光的物理简介 光吸收检测的原理与应用实例 荧光检测的原理与应用实例 发光检测的原理与应用实例,荧光原理,荧光：某些物质吸收特定波长的光能量（能量高），从基态(S0) 成为激发态(S1)；被激发的分子通过内部

5、转化失去能量并回到基态；同时发出波长更长的光（能量低）,荧光原理,Excitation in femtoseconds (10E-15 seconds) Internal in picoseconds (10E-12 seconds). Emission in the relatively long time period of nanoseconds (10E-9 seconds) Tremendously sensitive emission profiles, spatial resolution, and high specificity of fluorescence investigations, the technique is rapidly becoming an important tool in genetics and cell biology.,荧光的优势,灵敏度高可以低到单个分子 对环境敏感 细胞毒性较小，可以进行活细胞或活体检测 实时检测 多标记检测（如蓝色细胞核，红色线粒体等等） 检测模式多样，具有多种类型的荧光探针和荧光染料 兼容性强可以兼容多种仪器平

6、台和多种样本形式 使用方便，高效安全，无辐射,以荧光为基础的检测技术,荧光强度(FI) 时间分辨荧光(TRF) 荧光偏振(FP) 荧光共振能量转移(FRET) 均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET) 荧光寿命(FLT),荧光强度（FI）,DNA、RNA的荧光定量 荧光ELISA 酶动力学分析 药物代谢（CYP450） 氧化酶的呼吸爆发 细胞凋亡研究 细胞基础实验（细胞吸附、细胞渗透、细胞迁移、细胞增殖、细胞毒理研究等） 钙流检测 报告基因检测（GFP）,DNA的荧光定量,Figure 2 -DNA measured with PicoGreen（485/535nm）,Figure 1 -DNA measured with absorbance at 260 nm,灵敏度比较： 260nm光吸收： 50250ng/ml PicoGreen Fluorescence： 300pg/ml,细胞贴壁研究,细胞的贴壁性反映了细胞的状态，类型 传统方法：细胞计数，繁琐不准确 荧光强度方法,荧光标记细胞 微孔板 孵育 洗去未粘附细胞 检测板底荧光强度,死细胞数目检测,药物的毒性；外界刺激细

7、胞受损 死亡细胞的膜破裂 PI（Propidium Iodide），一种膜不渗透性DNA荧光染料 PI的荧光强度反映了死细胞数目,细胞凋亡分析,某些细胞凋亡的信号通路包括Caspase3的酶活性提高 模拟Caspase3底物,酶活性分析,药物代谢酶活性分析 细胞色素P450酶家族成员 负责大约20普通药物代谢 P450酶活性的调节 P450的抑制物的筛选,酶活性分析,底物构造 荧光染料封闭基团不发荧光 加入酶促反应之后，底物被切开，荧光染料与封闭基团分离 加入候选药物分子，可筛选作用于药物代谢通路的调解物,e.g. CYP3A4,酶活性分析,加入不同浓度的底物的CYP的反应曲线,CYP抑制剂筛选,紫外荧光,利用蛋白内部发色团（ Tryptophan、 Tyrosine、 Phenylalanine）作为荧光指示剂（紫外激发），可分别对蛋白结构,构象,亚基组装，酶与底物结合，蛋白结构的共效应因子进行研究。 发色团的暴露或掩藏 还可以研究一些电子传递链的耦连剂 NADH FAD B族维生素，维生素A，E检测,紫外荧光蛋白质的折叠/变性,RNase A 的热变性曲线,荧光强度应用的不足,部分

8、荧光素激发峰与发射峰往往相隔很近，干扰检测 发射光产生极快，且持续时间短，容易与激发光重叠，干扰检测,时间分辨荧光（TRF）,以镧系元素(稀土离子：铕、钐、镝、铽）为标记 发射功率低，螯合,时间分辨荧光（TRF）,激发波长与发射波长差距大（200nm） 光谱窄 发光时间长,Eu:激发波长320nm，发射波长612/620nm,时间分辨荧光（TRF）,和普通荧光相比，排除了背景光干扰 所有普通荧光强度（FI）检测，如干扰影响极大，无法排除，均可采用时间分辨荧光标记来解决,以荧光为基础的检测技术,荧光强度(FI) 时间分辨荧光(TRF) 荧光偏振(FP) 荧光共振能量转移(FRET) 均相时间分辨荧光(HTRF)/(TR-FRET) 荧光寿命(FLT),用FI的方法检测分子间结合,缺点： 1、步骤繁琐，需要洗涤 2、且每次洗涤强度很难一致，造成结果有差异，重复性差。,优点： 1、步骤简单，无需洗涤 2、试验均一性，重复性好,荧光偏振（FP）的原理,光的偏振性,荧光偏振（FP）的原理,如果荧光基团在处于激发态的时间内（如Fluorescein为4ns)保持静止，那么它发射出的荧光也是与激发光

9、是同平面的,荧光偏振（FP）的原理,如果荧光基团在处于激发态的时间内是运动状态，那么它发射出的荧光会发生偏振平面的改变,荧光偏振（FP）的原理,荧光偏振改变反映了分子的运动状态，也可以说反映了分子所处的环境的状态 分子运动快，偏振方向改变大 分子运动慢，偏振方向改变小 荧光偏振： 分子运动越快，P值越小 分子运动越慢，P值越大,荧光偏振（FP）的原理,分子体积与运动速度的关系 体积越大，运动速度越慢 体积越小，运动速度越快 分子所处环境与运动速度的关系 溶液的粘稠度 利用荧光偏振的特性可以研究相互作用 分子结合，体积改变，运动速度变化，P值相应发生变化 溶液状态变化，溶液的粘稠度改变，其中的分子运动速度变化，P值相应发生变化,荧光偏振（FP）研究分子相互作用,原则 荧光基团标记在小分子上，偏振值低 当小分子与较大的分子结合后体积增加，偏振值增加 偏振值的大小反映了两个分子之间的结合效率与结合数量,荧光偏振（FP）研究分子相互作用,配体受体结合 蛋白质与蛋白质结合 抗原抗体结合 蛋白质与DNA 的相互作用 DNA 杂交 酶活性检测 膜的流动性分析,Estradiol与Estradiol Receptor,ER：能和小分子疏水配体结合的核受体超家族成员，穿梭于胞浆和胞核内，具有转录因子的作用（DNA结合），包括ER、ER两种亚型 Estradiol（雌激素）：与ER结合，引起其入核，调节基因转录 Estradiol类似物,ER-竞争性结合物的筛选,雌激素受体ER-竞争性结合物可作为候选的药物成分 具体步骤 荧光标记的雌激素ES2与ER-结合，复合物较大，P值较大 加入竞争物之后，则能够将ES2替换下来，单独的ES2体积小，P值减小 P值的减小程度与竞争物的浓度的关系反映了竞争物的竞争性,ER-竞争性结合物的筛选,Estradiol-ER与DNA结合,ER核受体，Estradiol 与DNA结合，调节基因转录 传统方法EMSA 放射性，繁琐,Estradiol-ER与DNA结合,荧光偏振方法 亲和层析纯化ER FAM标记的DNA结合序列 偏振分析,激酶活性分析,竞争性免疫分析

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