2014植物细胞工程教学课件：第六章植物细胞培养及次生代谢产物生产

1、第六章 植物细胞培养 及次生代谢产物生产,培养过程：,培养物,外植体,愈伤组织,不定芽,根形成,愈伤组织诱导培养基,再分化培养基,生根培养基,植物细胞培养（Plant Cell Culture）:在离体条件下，对植物单个细胞或小的细胞进行培养和继代培养，大量获得细胞群体的技术。,植物细胞分离方法,机械分离法：将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化 优点：细胞不受酶伤害；有利于进行细胞的生理和生化研究。,酶解法:选择专一性水解酶在温和的条件下将植物细胞壁物质(纤维素、果胶、多糖)降解,从而使细胞彼此分开,获得单个细胞的方法 。 优点：可获得较多的游离细胞（但对禾本科植物叶片效果不好）。,植物细胞分离方法,愈伤悬浮法：从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团。 优点：细胞不受伤害，可获得较多的游离细胞或小的细胞团。,植物细胞分离方法,第一节 悬浮培养,细胞悬浮培养（Cell suspension culture)：将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行悬浮振荡培养，使其增殖的技术。,细胞悬浮培养技术,悬浮培养包括： 愈伤组织的诱导; 悬浮系的建立与细胞的生长增殖

2、,(一)愈伤组织的诱导,适宜于细胞悬浮培养的愈伤组织要求：松散性好、增殖快、再生能力强。 适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体 适宜的培养基：适当的激素浓度；必要的附加物质 多次继代筛选,外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。,适于悬浮培养 适于再生植株,(一)愈伤组织的诱导,(二)悬浮系的建立与继代培养,成功的悬浮细胞培养体系满足三个条件：,均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。,悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在2050个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。,细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般23天甚至更短时间便可增加一倍。,悬浮细胞的生长动态,指,指,指,1、细胞计数：单位体积细胞浓度； 2、细胞体积：培养物离心后测定细胞层所占的体积； 3、细胞鲜重或干重：过滤或干燥后称重,(三)悬浮培养过程中细胞生长情况分析测定方法,第二节 单细胞培养（single cell culture）,1、平板培养(plating culture) 2、看护培养(n

3、urse culture) 3、微室培养(micro-chamber culture) 4、双层滤纸培养(feeder layer cultur),1、细胞平板培养,将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。Bergman(1960)首创 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞。 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5105个/毫升 植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，其厚度为1-2mm左右。,细胞悬浮,过滤,与培养基混合,植板,培养,克隆愈 伤组织,1、细胞平板培养,平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。 每个平板形成的细胞团数 植板率 100% 每个平板接种的细胞总数,1、细胞平板培养,优点： 单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞株筛选和突变体筛选的常用方法。 由于它具有筛选效率高、筛选量大、操作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、分化、生理生化、遗传变异、次生代谢产物合成

4、等。 缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。,Muir(1953)首创此法获得烟草单细胞体系。 优点：简便易行，效果好。 缺点：不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。,2、看护培养,3、微室培养,3、微室培养,优点：可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程 缺点：培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。,把处理（如X射线处理）过的无分裂能力或分裂很慢的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长。,4、饲养层培养,第三节 规模化细胞培养生产次级代谢产物,一、代谢产物( metabolites),初级代谢产物(Primary metabolites)：生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。 次级代谢产物(Secondary metabolites)：是通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物碱、毒素等。,二、植物次生产物的主要类型酚类化合物,包括黄酮类、醌类和简单酚类 黄酮类： 结构： C6-C3-C6 生物合成前体：苯

5、丙氨酸和丙二酸单酰辅酶A。 功效：为治理心血管疾病和高血压的药物成分。 醌类化合物： 结构：由苯式多环芳烃衍生的芳香二氧化合物， 种类：苯醌、萘醌。 功效：呈现颜色，具有抗菌、抗癌作用。,二、植物次生产物的主要类型萜类化合物,组成单元：异戊二烯 种类：单萜、倍半萜、二萜、三萜以及甾类化合物。 单萜和倍半萜是植物挥发油和香料的主要成分，有的具有重要的药用价值，如抗疟疾药物青蒿素（倍半萜类）。 二萜生物碱：紫杉醇。 三萜皂甙：人参皂甙。 甾体皂甙：薯蓣皂甙。,二、植物次生产物的主要类型含氮化合物,包括生物碱、胺类、非蛋白质氨基酸和生氰苷，种类：5500种以上 生物碱的作用：药用，植物抗毒素。 目前对生物合成途径研究比较清楚的有： 烟草的烟碱(nicotine)、毒藜碱(anabasine) 和吡咯生物碱 (pyrrolizidine alkaloid)， 毛茛科植物的小檗碱(berberine) ， 曼陀罗属植物的莨菪碱(tropine)和东莨菪碱(scopolamine) 。,二、植物细胞培养生产代谢产物的意义,例：紫杉醇（Taxol）是从红豆杉属植 中分离得到的一种双萜类化合物。C47

6、H51NO14， 分子量：853.90 用途： 具有良好的抗癌活性，尤其对晚期 、转移性卵巢癌、乳腺癌、肺癌有 、转移性卵巢癌、乳腺癌、肺癌有 十分显著的疗效。 制备途径： 1.直接从红豆杉中提取； 2 化学全合成 化学半合成 ； 3.内生真菌培养； 4植物细胞培养。,提取：在不同红豆杉属植物树种和树木的不同部位(如树皮、木材、树叶、嫩枝和幼苗等)含量有所不同，以树皮、嫩芽中含量最高，心材最低。一般含量为0.005% 左右。生产1kg紫杉醇需要砍伐60年生大树3000-4000棵。若光从树皮中提取紫杉醇，每年需砍伐150-200万棵左右的大树。破坏宝贵资源、不可持续发展。 化学合成 ：结构复杂，全合成需要几十步合成步骤 ，总得率仅4-5%。成本高,二、植物细胞培养生产代谢产物的意义,生产方式 生产周期 紫草素含量（干重） 完整植物 23年 12 植物细胞培养 3周 14,规模化细胞培养是生产植物次生代谢产物的理想途径。,二、植物细胞培养生产代谢产物的意义,植物次生代谢产品的市场潜能 产品成分 用途 年销售额（亿美元） 长春花碱 治疗白血病 1820（美国） 奎宁 治疗疟疾 510（美国

7、） 致热素 杀虫剂 20（全世界） 毛地黄 心脏病药 2055（美国）,三、规模化细胞培养,(一)植物细胞特点,Q.植物细胞与微生物细胞相比 有些什么特点？,1、细胞本身的特性, 细胞体积比微生物细胞大（10200m），是微生物细胞的30100倍； 植物细胞生长速度慢； 植物具大液泡和细胞壁，易受机械剪切力的影响； 细胞常以非均相细胞团的方式生长。,2、植物细胞的培养特性,细胞培养中易结团，造成粘附、贴壁，影响细胞的正常生长； 细胞培养过程中易产生黏多糖等物质，导致黏度增大，降低传氧速度； 植物细胞培养基成分丰富而复杂，适合微生物生长，因此防止污染更困难； 植物细胞培养一般需要光照；通过光合作用于合成有机物，因此CO2、O2含量与传递对细胞培养影响较大,（二）植物细胞规模化培养过程,1、细胞株（种子细胞）的选择 2、筛选细胞株的增殖与放大培养 3、大规模培养体系的建立生物反应器培养,细胞株（Cell Strain),细胞系(Cell line)：经继代培养纯化，获得的以一种细胞为主的能在体外长期生存的不均一的细胞群体。 细胞株(Cell strain)：从一个经过生物学鉴定的细胞系用单

8、细胞分离培养或通过筛选的方法由单胞系增殖形成的细胞群。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群 。,1、细胞株的诱导与筛选诱导,愈伤组织的诱导与培养 单细胞的分离 细胞无性系的分离 细胞株的筛选,1、细胞株的诱导与筛选筛选,（1）分散性好，适合大规模悬浮培养； （2）均一性好，细胞大小、生理状态一致； （3）生长速度快，培养周期短，不易染菌； （4）目标产物含量高，容易分离提取； （5）细胞遗传稳定。,适合大规模培养的细胞株应具备何条件？,单细胞培养法,1、细胞株的诱导与筛选筛选,2、筛选细胞株的增殖培养,悬浮培养（摇瓶培养），逐级放大，获得大量的活跃生长的种子细胞群体； 细胞株鉴定：经常鉴定，防止细胞株退化和变异。,3、大规模细胞培养 生物反应器培养技术,植物细胞大规模培养方式： （1）成批培养：在一个培养体积中接种细胞或添加培养基后，中途不添加也不更换培养基的方式。 （2）连续培养：在培养过程中，不断向反应器中以一定流量添加新培养基，同时以一定流量从系统中取出培养基的方式。 (3)半连续培养：在完成成批培养的一个周期后，从反应器中取出大部分细胞悬液，只保留小部分细胞悬液作

9、为下一培养周期的种子细胞，然后加入新鲜培养基进行培养的方式。,（1）生物反应器的类型及特点,悬浮培养系统生物反应器 固定化培养系系统生物反应器,悬浮培养生物反应器系统,机械搅拌式 气升搅拌式 鼓泡式,机械搅拌式生物反应器,机械搅拌式生物反应器通常是在微生物发酵罐的基础上改进设计。,搅拌装置要减少剪切，改叶轮式为螺旋式；,因为植物细胞生长周期长，需要随时补充水分和营养，因此必须设计加液装置；,由于植物细胞的生理活动需要新鲜空气，且细胞代谢也可能产生有害气体，所以必须设计通气装置；,为便于取样观察，一般还设计有取样口。,气升式生物反应器,气升式生物反应器： 优点：供氧剪切力小，对细胞损伤小，易长期无菌培养。 缺点：操作弹性小，低气速或培养后期混合效果差；此时如果提高通气量又会产生大量泡沫。,5L 气升式植物细胞（或器官）培养罐,气升循环式生物反应器,内环式,外环式,鼓泡式生物反应器,悬浮培养生物反应器系统的比较,类型 溶氧性 破坏性 混合度 限制因素 机械搅拌式 中 强 较均匀 细胞浓度高时混合不匀 气升搅拌式 高 低 均匀 细胞浓度高时有死角 鼓泡式 中 低 不均匀 有死角，发生细胞沉降,细胞固定化：指将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状态，进行无菌培养的一种技术。,固定化反应器,固定化培养的优点：,可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节；,细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；,由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；,正是由于

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