感染性疾病分子诊断2013

1、分子诊断学,陈昌杰,病因 内因和外因两大类 内因主要指遗传因素，如基因结构、基因表达状况的改变，其中基因结构的改变包括点突变、插入、缺失、重排、易位、基因结构多态性变异、前病毒插入等；而基因表达状况改变则包括转录产物的结构或表达量的异常。 外因是指外在的环境因素，如生活方式、工作环境、精神状况和各种感染性病原体的侵入等。,第十章 感染性疾病的分子诊断 分子诊断（molecular diagnosis）是指通过检测基因的结构异常或其表达异常，对人体的健康状态和疾病作出诊断的方法。 评估基因的存在和缺陷通常以DNA为材料，而评估基因的表达量则以基因转录或翻译的产物RNA/蛋白质分析来评估个体的生理/病理状态。,分子诊断技术主要包括 核酸杂交 聚合酶链式反应（PCR） 基因芯片技术,感染性疾病即由病原微生物引起的疾病的统称 。 外源性感染：指由外界致病病原体侵人人体后导致的感染，如伤寒、病毒性肝炎等多为外源性感染。 内源性感染：指由人体自身的正常菌群，在人体免疫功能下降时引起的感染，因为这些细菌必须在一定条件下才能致病，所以又称为条件致病菌或机会致病菌，如肠道菌群中的大肠埃希菌、肠球菌等引起

2、的感染多为内源性感染。,分子诊断对感染性疾病可用于以下几个方面： 适用不易培养的； 种属鉴定； 早期诊断； 动态监测； 流行病学调查； 基因分型； 耐药检测。,感染性病原体进行分子诊断，取决于两个条件： 一是在该病原体核酸中有特异的核酸序列（感染性病原体本身含有一些保守序列，即使在不同的基因型这些保守序列的变异也很小，因此可以根据保守序列设计探针或引物）； 二是能够根据特异的核酸序列设计和制备具有特定信号的探针或设计合成相应PCR引物，多数感染性疾病的病原体都具备上述两个条件。,诊断策略可以分为以下两种： 一般性检出策略 完整检出策略,一般性检出策略所提供的感染性病原体的信息量较少，几乎不提供型别（包括变异株）和耐药性方面的信息 ，因此，对于感染感染性疾病分子诊断一般性策略只是快速诊断是何种病原体的感染。,为了得到更多的疾病病原体信息，建议应该采取完整策略按照诊断分型亚型耐药性检测的思路，利用多种分子诊断手段对感染性病原体进行分析。,第一节 病毒的基因检测 人类许多感染性疾病由病毒引起，如肝炎、脑炎、脊髓灰质炎、流行性感冒、狂犬病、艾滋病等。根据病毒的核酸成分，可将其分为脱氧核糖核酸（

3、DNA）病毒和核糖核酸（RNA）病毒两大类。,一、乙型肝炎病毒 乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是引起病毒性肝炎的主要病原体之一，属嗜肝DNA病毒科的原型病毒，病毒毒粒中含内源性DNA聚合酶活性。嗜肝病毒科有独特的复制方式，病毒合成以RNA中间体为模板，经反转录合成DNA链，在某些方面，HBV与逆转录病毒有许多相似性。,乙型肝炎病毒( HBV) 感染是一个严重的全球问题, 据估计全球大约有20 亿人曾经感染乙肝病毒, 慢性HBV感染者约315 亿 4 亿人, 每年有50 万 120 万人死于HBV 感染。我国是乙型肝炎的高发区, 每年约有10% 20%的急性乙肝将转成慢性肝炎, 肝硬化甚至发展成肝癌,严重威胁着人们的健康, 急性乙肝的慢性化及慢性肝炎癌变的发生机制是多年来肝病研究的重点。,HBV 感染的病原学诊断 免疫血清学检测 HBV 的血清学标志物 分子生物学方法检测 免疫学方法测定病毒抗体是一种快速简便的检测手段, 常用的方法是间接ELISA, 目前我国HBV 检测采用的第三代ELISA 试剂由多种病毒抗原组合匹配, 具有较好的灵敏性和特异性, 但其在

4、病毒感染的窗口期不能检测到抗体, 这在很大程度上限制了ELISA 检测的准确性, 不能有效的控制病毒的传播, 因而, 发展新的诊断HBV 感染主要依赖分子生物学技术对病毒DNA 的检测。,（一）病毒基因组结构 HBV是一种可感染人体、且具有独立复制能力的双链DNA病毒，具有以下几个特点： 不完全双链环状结构； 利用重叠的开放读码框架(ORF)可编码多个蛋白质； 所有调控序列均位于蛋白质编码区； 基因序列具有多变性。HBV基因组是已知可感染人类又能独立进行复制的双链DNA病毒中最小和最高效的。,HBV基因组具有独特的结构，是一个长约3.2 kb的不完全双链环状DNA。双链的长度不对称，长链(L)因与病毒mRNA互补，定为负链；短链(S)为正链，5末端固定，3末端位置不固定，S正链的长度可为L负链的50100%，因而在病毒群体中出现不同长度的正链与全长的负链匹配，故仅有部分基因组长度为双链。HBV基因组L链上至少有4个ORF，分别称为S、C、P和X，编码外膜蛋白、核壳蛋白、聚合酶和X蛋白。多个ORF重叠的结果使HBV本身3.2 kb基因组序列的利用率高达150200%。,（二）分子诊断方法

5、 1PCR 2. 支链DNA技术 3. 核酸杂交 4. 基因芯片技术,逆向斑点杂交法 原理就是将各种探针固定在基质上, 用以检测受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的变化。,FeO/ Au 纳米颗粒探针法 近年来, 通过纳米表面结合寡核苷酸构成纳米颗粒基因探针, 用于检测靶脱氧核糖核酸。其原理是利用DNA 碱基严格互补配对的特性设计的, 主要应用于分子的组装。,聚合酶链反应- 限制性片段长度多态性法 该法利用错配PCR 的原理扩增HBV 前C 区长194 bp,C 启动子区长184 bp 的基因片段, 扩增产物分别经限制性内切酶Bsu 361, Bc1I 酶切, 琼脂糖凝胶电泳, 根据酶切图谱多态性, 建立检测HBV 前CA1896, BCPT1762/ A1764双变异的方法,乙型肝炎病毒DNA 等温扩增技术 HBV 的病毒载量与感染状态密切相关, 寻求快速、简便、灵敏、特异的定量手段是对HBV 早期诊断、病程监控及流行病学调查的需求。,（三）临床意义 1HBV感染的早期诊断 2. 监测治疗效果 3. 判断病情，指导制订合理的治疗方案 HBV DNA定量检测是判断病毒复制情况的指

6、标。HBV DNA拷贝数越高，病毒复制越厉害，传染性越强，肝脏病理损害程度越高，肝组织炎症反应越重。 4. 在乙型肝炎病毒耐药检测中的应用,HBV DNA 检测是乙肝病毒抗病毒治疗的有效监测指标。乙肝病毒药物治疗后, HBVDNA 含量持续下降, 然后持续在低水平, 或低至方法学能检出的含量( 测定下限)以下, 则说明治疗有效。观测抗病毒药物治疗效果不能凭两三次检测结果来判断, 必须多次动态观察, 每次检测的间隔天数不宜太短, 一般为两周以上。可采用以检测次数为横坐标, HBV DNA 量为纵坐标作图的方法来判断血清HBV DNA 量的变化趋势, 进而判断抗病毒治疗是否有效。血循环中HBV DNA 浓度与HBsAg 和HBeAg 有一定的相关, 但其浓度间并不呈正线性相关。,拉米夫定作为新一代核苷类高效抗乙肝病毒药物，可迅速降低HBV-DNA的浓度，改善肝脏组织的病变，还可能阻止纤维化的进程，终止肝硬化的发展，尤其是拉米夫定不受人种、病毒感染的模式、野生型或基因组前C区突变的影响。该药与干扰素合用有协同作用。,长期服用拉米夫定会引起HBV基因突变而造成耐药，其中95%是由于HBV基因组

7、P区中高度保守的YMDD功能区（Y酪氨酸M甲硫氨酸D天冬氨酸- D天冬氨酸）发生突变：第552位甲硫氨酸（M）被缬氨酸（V）或异亮氨酸（I）代替，突变后的HBV称为YVDD变异株和YIDD变异株。由于变异造成基因组核苷酸与DNA多聚酶的结合能力有降低，通常变异株的复制能力低于野生株。当停止应用拉米夫定治疗后，野生株通常会替代变异株。,HBeAg 阳性的标本,HBV DNA 通常有较高的浓度, HBeAg 阴性、抗HBe 阳性的标本, HBV DNA 浓度通常较低。当HBV 基因组前C 区发生突变时, 则可出现HBeAg 阴性而HBV DNA 仍保持在较高的浓度。单独抗HBc 阳性的血液HBVDNA 浓度通常很低。,关于血液中HBV DNA 浓度与患者传染性之间的关系, 如血清中HBV DNA 浓度大于109 拷贝/ ml, 则在日常生活密切接触中即具有较强的传染性。105 106 拷贝/ ml,则在日常生活密切接触中的传染性较小。小于105 拷贝/ml, 则日常生活密切接触中几乎没有传染危险性。但不管HBV DNA 的浓度为多少, 哪怕是低于相应PCR 方法的下限, 也均会引起输血后的

8、感染。,基因分型方法, 一种在临床上准确、快速、简便地对乙型肝炎病毒进行基本分型( BCD) 的方法, 该方法通过大量分析已分型的HBV 基因组序列, 寻找出HBV 各基因型的型特异性硷基的分布规律, 设计型特异性的引物和探针, 利用已知全序列HBV 建立荧光PCR 是目前最灵敏的检测方法之一, 检测极限可达到100 copise/ ml的DNA 浓度。,二、丙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)属黄病毒科。目前发现约90%的输血后非甲非乙型肝炎和7080%的无输血史的散发型非甲非乙型肝炎由HCV感染所致。部分HCV感染者不出现临床症状，但有50%会发展成为慢性，且易致肝硬化和肝癌。HCV主要通过输血感染(是输血后肝炎的主要致病因子)，也可由静脉注射或母婴和家庭内接触而获得。,（一）病毒基因组结构 丙型肝炎病毒呈球形颗粒，直径约50nm，有一脂质包膜。核心含单股正链RNA，长9.4 kb。整个基因组只有一个可读框，位于基因组中央，编码一条含有,RNA病毒中的RNA能自我复制，大部分RNA病毒是单链的，复制一般是先以自己为模板合成一条互补的单链，病毒原

9、有的、起模板作用的链称为正链，新复制的RNA链称为负链。,（二）分子诊断方法 1PCR 2. 核酸杂交 3. bDNA技术 4. 基因芯片技术,1. 定性检测 虽然抗HCV并不是保护性抗体，临床上可以根据抗HCV来判断是否感染，但由于患者免疫功能的差异，仅有部分患者出现抗HCV，且抗HCV尚会出现时阴时阳的表现。采用分子生物学技术检测到HCV RNA的存在是HCV感染的确证标志。检测HCV-RNA可对丙型肝炎作早期诊断，解决了免疫学检测的“窗口期”问题，可判断疾病是否处于隐性或亚临床状态。在HCV的感染中，第一周内就可以检测出HCV RNA，,2. 定量检测 可判断HCV的传染性及病毒复制情况，进行病情评估、判断病人预后。还可通过对HCV RNA拷贝数的监测，评价干扰素和其他抗病毒药物的疗效。另外，人们注意到临床分型与疗效的关系，发现如III型HCV患者对干扰素的疗效更佳，此时也需要采用分子生物学技术对HCV进行病毒分型。,三、人类免疫缺陷病毒 人类免疫缺陷病毒HIV)，顾名思义它会造成人类免疫系统的缺陷。1981年，人类免疫缺陷病毒在美国首次发现。它是一种感染人类免疫系统细胞的慢病毒，属反转录病毒的一种。至今无有效疗法的致命性传染病。该病毒破坏人体的免疫能力，导致免疫系统的失去抵抗力，而导致各种疾病及癌症得以在人体内生存，发展到最后，导致艾滋病(获得性免疫缺陷综合症)。,人类免疫缺陷病毒是艾滋病的病原体，自1983年首次分离出第一株HIV以来，现已发现引起艾滋病的病毒有HIV-1、HIV-2、HIV-3等3种。,在感染后会整合入宿主细胞的基因组中，而目前的抗病毒治疗并不能将病毒根除。 病毒基因变化多样;广泛存在于感染者的血液、精液、阴道分泌物、唾液、尿液、乳汁、脑脊液、有神经症状的脑组织液，其中以血液、精液、阴道分泌物中浓度最高;对外界环境的抵抗力较弱，对乙肝病毒有效的消毒方法对艾滋病病毒消毒也有效;感染者潜伏期长、死亡率高; 病毒基因都复杂。,体外生存 人类免疫缺陷病毒在人体外生存能力极差，不耐高温，抵抗力较低，离开人体不易生存，常温下只可生存数小时至数天。 HIV对热敏感。在56条件下30分钟即失去活性，但在室温保存7天，仍保持活性。 灭活方法,不加稳定剂病毒在-70冰冻下失去活性，而35%山梨醇或

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