发酵工程的灭菌与空气除菌

1、第五章 发酵工程的灭菌 和空气除菌,黄小龙 农学院生物技术系,本章内容,第一节 常用的灭菌方法 第二节 培养基与发酵设备的灭菌 第三节 空气的除菌,1) 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力； 2) 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主； 3) 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难； 4) 杂菌会降解目的产物；杂菌会污染最终产品； 5) 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象。,在发酵过程中染菌严重的后果,第一节 常用的灭菌方法,一、定义 1、培养基灭菌的定义 从培养基中杀灭所有有生活能力的微生物营养体及其孢子，或从中将其除去。 工业规模的液体培养基灭菌，杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。,第一节 常用的灭菌方法,2、灭菌与消毒的区别 灭菌（sterilization）：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。,二、工业生产中的灭菌 1、工业上具体措施包括: （1）使用的培养基和设备须经灭菌； （2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理； （3）

2、设备应严密，发酵罐维持正压环境； （4）培养过程中加入的物料应经过灭菌； （5）使用无污染的纯粹种子。,二、工业生产中的灭菌 2、培养基灭菌的目的 杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。 3、培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度(10-3)。 （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。,4、灭菌的方法 （1）化学法（化学药品灭菌法）： 化学药品直接作用于微生物而将其杀死的方法。消毒剂与防腐剂的区分并不严格。 灭菌机理： 化学物质（高锰酸钾、漂白粉等）与微生物细胞中的某些成分产生化学反应，如蛋白质变性、核酸的破坏、酶的失活、细胞膜透性的改变而杀死微生物。,常用的化学药剂： 石碳酸、甲醛、氯化汞、碘酒、酒精等。主要用于生产车间环境、无菌室空间、接种操作前小型器具及双手的消毒等以及染菌后的培养基。 根据灭菌对象的不同使用方法有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。,9,（2）物理法 射线灭菌法： 利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的射线进行灭

3、菌的方法。波长范围在200275nm的紫外线具有杀菌作用，杀菌作用最强的范围是250 270nm，波长为253.7nm的紫外线杀菌作用最强。 在紫外灯下直接暴露，一般繁殖型微生物约3 5min，芽孢约10min即可杀灭。,紫外线灭菌机理： 在紫外线照射下微生物细胞的DNA遭到破坏，形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧啶水合物，抑制DNA的复制。此外，空气在紫外线照射下生成的臭氧也有一定的杀菌作用。,11,紫外线穿透力较差，一般只适于接种室、超净工作台、无菌培养室及物质表面杀菌。不同微生物对紫外线的抵抗力不同，对杆菌杀灭力强，对球菌次之，对酵母菌、霉菌等较弱，因此常与化学灭菌结合使用。,（2）物理法 干热灭菌法 ： 灭菌机理：在干燥高温条件下，微生物细胞内的各种与温度有关的氧化还原反应速度迅速增加，致死微生物。 灼烧灭菌法；玻璃器皿、金属器材和其他耐高温的物品在干热灭菌器中，于160下保存1h。有纸或棉塞者灭菌不能超过170。,（2）物理法 过滤除菌： 使用适当的过滤材料或介质对液体或气体进行过滤，除去微生物的方法。 主要适用于：热敏感物质（生长因子、抗生素、培养基）的灭菌和发酵用无菌空气的制备。,

4、湿热灭菌法： 利用饱和蒸汽进行灭菌。释放大量热量和强大穿透力使生物大分子化学键受到破坏。常用于培养基、发酵设备、附属设备、管道和实验器材的灭菌。 煮沸灭菌法：将物品在水中煮沸15-20min，一般微生物细胞可杀死，但不能杀死孢子。适用于食品、器具消毒。无芽孢菌用60 10min，芽孢用100 10min以上，嗜热细菌用120 20-30min可完全杀死。,间歇灭菌法： 反复几次的常压蒸汽灭菌，已达到杀死微生物营养体和芽孢的目的。100 30-60min而杀死微生物营养体，置37 培养1h，使其芽孢发育成营养体，次日再同样的方法处理，反复3次。适用于不能高压灭菌的物质，如糖类、明胶、牛奶培养基等。 高压蒸汽灭菌： 使用密闭的高压蒸汽灭菌锅。实验室常用压力为0.1兆帕（MPa，一公斤的压力），121 15-30min，可杀死各种微生物及芽孢。常用于培养基、发酵设备、管道、实验器材等。,第二节 培养基与发酵设备的灭菌,一、影响培养基灭菌的因素 （1）培养基成分 培养液中油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性。高浓度盐类、色素能削减其耐热性。,随着灭菌条件的强化, 培养基成分的热变质

5、加速，特别是维生素。因此培养液灭菌一般都采用高温短时加热的方式，这样可以达到彻底灭菌和把营养分破坏减少到最低限度的目的。,一、影响培养基灭菌的因素,（2）培养基成分颗粒度 培养基成分的颗粒越大，蒸汽穿透所需时间越长。小于1mm颗粒的培养基，可不必考虑颗粒对灭菌的影响，但对于含有少量大颗粒及粗纤维培养基的灭菌，特别是存在凝结成团的胶体时会影响灭菌效果，则应适当提高灭菌温度或过滤除去。,（3）培养基pH pH对微生物耐热性影响很大。微生物一般在pH6.08.0时最耐热；pH6.0，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡。pH越低，灭菌所需时间越短。,（4）微生物细胞含水量 含水量少，蛋白质不易变性，但在灭菌时，如果是含水量很高的物品，高温蒸汽的穿透效果也会降低，所以灭菌时间也要延长。,（5）微生物性质与数量 1) 各种微生物对热的抵抗力相差较大，细菌的营养体、酵母、霉菌的菌丝体对热较为敏感，而放线菌、酵母、霉菌孢子对热的抵抗力较强； 2) 繁殖期的微生物对高温的抵抗力比衰老期微生物抵抗力 小得多； 3) 微生物数量越多，所需灭菌时间越长； 4) 天然原料配成的培养基含菌

6、量高于纯粹用化学试剂配制成的组合培养基。,（6）冷空气排除情况 冷空气不但导热性差，阻碍蒸汽接触欲灭菌的物品，还会降低蒸汽分压，使罐内实际温度低于压力表所对应的温度，造成灭菌温度不够。 （7）泡沫 泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去，需加消泡剂。 （8）搅拌 避免局部过热或形成灭菌死角。,二、培养基的灭菌 无菌的标准： 根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝对无菌是很难做到的，也是不必要的。因此在工程设计中常取N=10-3(N:培养基中残存的活菌数）。 工业化生产中培养基的灭菌采用湿热灭菌方式，主要有两种方法：分批灭菌和连续灭菌。,（一）分批灭菌（batch sterilization）,又称间歇灭菌，就是将配制好的培养基全部输入发酵罐内或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定时间，再冷却到接种温度，这一工艺过程称为实罐灭菌，是使培养基和发酵罐同时灭菌的一种方式。,优点：无需专一灭菌设备，操作简便。 缺点：加热和冷却时间较长，易发生过热破坏营养分 的现象，发酵罐利用率低。 灭菌流程：包括：加热、维持、冷却3阶段。,流程操作： 先预热一定时间，使物料溶胀均

7、匀受热，预热90以上时，将蒸汽直接通入培养基及罐中，可减少冷凝水生成量。温度达到120时计算维持时间。生产中常用维持时间30min。为了减少营养成分的破坏多采用快速冷却方式，立即向罐内通入无菌空气，以维持罐压,然后开启冷却系统进行冷却。,分批灭菌设备示意图,三路进汽：蒸汽从通风、 取样和出料口进入罐内 直接加热，直到所规定 的温度，并维持一定的 时间。这就是所谓的 “三路进气”。 四路出汽：在液面以上 的管道口则应排放空 气，即蒸汽从排气、接 种、进料和消沫剂管排 气。这样做可以达到不 留灭菌死角。,（二）连续灭菌(continuous sterilization),连续灭菌是将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式，也称之为连消。 连续灭菌设备主要由灭菌系统、冷却系统、烘干系统及电器系统组成。附属设备由进料输送带散布机，出料输送带等组成。 灭菌系统采用专一灭菌设备-连消塔(或器)。,优点： 高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少； 发酵罐的非生产占用时间短，容积利用率提高； 热能利用合理，适合实行自动化控制； 缺点： 不适用于粘度大或固形物含量

8、高的培养基灭菌； 增加一套连续灭菌设备，增多了操作环节，增加染菌 的机率。,连消塔-喷淋冷却连续灭菌的基本流程,流程：在短时间内使物料在连消塔中的温度达到灭菌温度126132，然后进入维持罐中保温5 8min，然后物料以层流的方式保持先进先出、后进后出的状态流至维持罐出口完成灭菌时间，再进入冷却器快速换热冷却后进入灭菌完毕的发酵罐中。,喷射加热-真空冷却连续灭菌流程图,典型的蒸汽喷射式-真空冷却过程中培养基温度随时间的变化曲线,喷射器结构示意图,连续灭菌与分批灭菌的比较,1、连续灭菌的优缺点 优点 保留较多的营养质量； 容易放大； 较易自动控制； 糖受蒸汽的影响较少； 缩短灭菌周期； 在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均匀。 缺点 设备比较复杂，投资较大。,2、分批灭菌的优缺点 优点 设备投资较少； 染菌的危险性较小； 人工操作较方便； 对培养基中固体物质含量较多时更为适宜； 缺点 灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。,（三）固体培养基灭菌,固体培养基要先蒸煮灭菌,但固体培养基呈粒状、片状或粉状，流动性差，不易翻动，吸水

9、加热易成团, 冷却困难。针对这些特点设计的转鼓式灭菌机常用于酒厂、酱油厂。,转鼓式灭菌器，可以0.51r/min转动，培养基能得到较为充分的混匀，轴的中心是一带孔的圆管，蒸汽沿轴中心通入鼓内培养基中进行加热，达到一定温度后，进行保温灭菌。灭菌结束后用真空泵对转鼓抽气，降低鼓内压力和培养基的温度。,三、管道与发酵罐等的灭菌,（1）种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管 道灭菌 从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达0.147 MPa，维持45 min，灭菌过程从阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过到达死角灭菌。 （2）空气总过滤器和分过滤器灭菌 排出过滤器中的空气，从过滤器上部通入蒸汽，并从上、下排气口排气，维持压力0.174 MPa灭菌2 h。灭菌完毕，通入压缩空气吹干。 （3）补料实罐灭菌 根据料液不同而异，淀粉料液为121 ，维持5 min；尿素溶液灭菌 105 ，维持5 min。,第三节 空气的除菌,一、发酵使用的净化空气的标准 二、空气净化的方法 三、介质过滤除菌的原理 四、空气净化的工艺流程,一、发酵使用的净化空气的标准,（一）无菌空气的概念 发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。,一、发酵使用的净化空气的标准,（二）空气中微生物的分布 空气中的含菌量随环境不同而有很大差异： 一般干燥寒冷的北方空气中的含菌量较少， 而潮湿温暖的南方则含菌量较多； 人口稠密的城市比人口少的农村含菌量多； 地面又比高空的空气含菌量多。,各地空气中所悬浮的微生物种类及比例各不相同，数量也随条件的变化而异，一般设计时以含量为103104个m3进行计算。,（三）发酵对空气无菌程度的要求 各种不同的发酵过程，对空气无菌程度的要求也不同： 不同菌种的生产能力、生长速度、发酵周期、产物性质、培养基营养成分和pH的差异等不同，对空气质量有不同的要求； 如：氨基酸和抗生素因发酵周期长短的不同；对无菌空气 要求不同。,发酵工业的“无菌空气”；一般按染菌机率为10-3来计算，即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许12次

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