茜素红染色预实验
5页1、茜素红染色 成骨分化是干细胞的一个重要特性。在特定的诱导培养基作用一段时间后,干细胞可分化为成骨细胞,在细胞表面沉积钙盐,形成钙结节。应用茜素红的复合物,可用于鉴定干细胞是否已成功向成骨细胞转化1 实验目的:通过茜素红染色检测细胞成骨分化2 实验原理:1.成骨诱导的过程是使钙离子能够以钙盐的方式沉淀下来,即“钙结节”,鉴定钙结节的染色方法常用茜素红染色法。2.茜素红:茜素磺酸钠,茜素S,茜素红S,茜素胭脂红,1,2-二羟基蒽醌-3-磺酸钠,1,2-二羟基蒽醌-3-磺酸钠盐。橙黄色或黄棕色粉末。易溶于水,微溶于乙醇,不溶于苯和氯仿。1%水溶液pH为2.15,其水溶液呈前黄褐色,加盐酸后变为黄色,加氢氧化钠后则变成蓝紫色。有刺激性。能与许多金属离子生成有色化合物,能与锆、钍、铝、钛及钙发生显色反应。3.染色原理:茜素红与钙发生显色反应,产生一种深红色的带色化合物,这样成骨诱导的细胞外面沉积的钙结节也就被染成了深红色。三实验试剂及仪器 1.试剂:PBS 10%甲醛缓冲液 0.1%茜素红-Tris-HCL染液 蒸馏水 2.仪器:倒置显微镜4 实验步骤1.弃培养液,PBS冲洗2次2.10%甲醛缓
2、冲液固定10min3. 蒸馏水冲洗3次4. 加入0.1%茜素红-Tris-HCL染液(pH8.3),37下染色30min5. 蒸馏水冲洗6. 在倒置显微镜下观察有无茜素红染色阳性细胞5 实验结果及讨论 RT-PCR检测PPARmRNA表达水平实验目的:定量检测干细胞中PPARmRNA的表达水平实验原理:1.由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”,由依赖RNA的DNA聚合酶(逆转录酶)来完成。随后,DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成,随每个循环倍增,即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶H降解,留下互补DNA。2.RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术,可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断,并且可以用于定量监测某种RNA的含量。检测基因表达的方法,参见Northern Blot法。3.RT-PCR的关键步骤是在RNA的反转录,要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。药品及耗材:凝胶电泳检测设备 PCR仪实验方法:1. 采用TRIzol提取总RNA,并用凝胶电泳检测RNA含量。2. 取1g总RNA,用随机引物和反转录试剂盒合成cDNA。3. 94,变性40s4. 48退火30s5. 72延伸40s6. 扩增目的基因共循环反应35次,末次结束循环7. 72再延长反应10min8. 扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳9. 使用Gelpro凝胶成像突向分析系统进行半定量分析10. 用PPAR的吸光度与GAPDH的吸光度比值表示PPARmRNA的相对含量
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