引物设计(丁香园)
5页1、引物设计有3条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素,如引物长度(primer length),产物长度(product length),序列Tm值(melting temperature),引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability, 用G值反映),形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构(duplex formation and hairpin)的能值,在错配位点(false priming site)的引发效率,引物及产物的GC含量(composition),等等。必要时还需对引物进行修饰,如增加限制性内切酶位点,引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结,引物设计应注意如下要点:1. 引物的长度一般为15-30 bp,常用的是18-27 bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74,不适于Taq DNA聚合酶进行反应。2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3端相似
2、性较高的序列,否则容易导致错配。引物3端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增加。3. 引物3端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应当避免在引物的3端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。4. 引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法,如按公式Tm4(G+C)2(A+T),在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) 。6. G值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3端G值较低(绝对值不超过9),而5端和中间G值相对较高的引物。引物的3端的G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高(超
3、过4.5kcal/mol)易导致产生引物二聚体带,并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。8. 对引物的修饰一般是在5端增加酶切位点,应根据下一步实验中要插入PCR产物的载体的相应序列而确定。值得一提的是,各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难,例如GC含量偏高或偏低,导致找不到各种指标都十分合适的引物;在用作克隆目的的PCR因为产物序列相对固定,引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次,尽量去满足条件。(转载)现在针对PCR引物设计的引物有好几种:Oligo 6.22 Primer 5.0 等 ,如果你对引物没有特殊要求也可以利用generunner进行设计引物,近来我一直都在用其设计引物效果也是不错的.具体方法可以参照各自使用说明书.一般是通过设计软件,例如oligo6,primer5等,你可以在网上搜一下引物设计软件下载和使用说明,是比较容易的。至于设计引物的一般原则如下:* 序列选取应在基因的保守区段* 避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对,避免引物自身形成环状发卡结构 * 典型的引物18到24个核苷长。引物需要足够长,保证序列独特
4、性,并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核苷的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交,降低了特异性,而且比短序列杂交慢,从而降低了产量。* Tm值在5565(因为60核酸外切酶活性最高),GC含量在40%60%* 引物之间的TM相差避免超过2* 引物的3端避免使用碱基A,引物的3端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基* 为避免的扩增,引物设计最好能跨两个外显子。* Taqman探针PCR要求片段长度在80bp150bp * 引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G和C。怎么设计引物来源:张小伟的日志1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因,通过序列分析软件(比如DNAman)比对(Alignment),各基因相同的序列就是该基因的保守区。2.引物长度一般在1530碱基之间。引物长度(primerlength)常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。3.引物GC含量在40%60%之间,T
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