电子文档交易市场
安卓APP | ios版本
电子文档交易市场
安卓APP | ios版本

生物制药课件(第五章)

98页
  • 卖家[上传人]:F****n
  • 文档编号:88204992
  • 上传时间:2019-04-20
  • 文档格式:PPT
  • 文档大小:6.16MB
  • / 98 举报 版权申诉 马上下载
  • 文本预览
  • 下载提示
  • 常见问题
    • 1、,第五章 多肽与蛋白质类药物,本章主要内容 多肽及蛋白类药物的一般生产方法 重要的多肽类药物生产工艺 重要的蛋白质类药物生产工艺 本章要求 (1)掌握蛋白质提纯的一般方法 (2)掌握肽的固相合成法 (3)熟悉胸腺素、干扰素、胰岛素、白蛋白的制备工艺 (4)了解胃膜素等的生产方法,第一节 多肽及蛋白质类药物的生产方法,一、蛋白质类药物的分离与纯化 (一)材料选择 原料来源:动、植物组织和微生物 选择原则: 富含所需蛋白质多肽成分 易得 易提取 无害,基因工程菌(或细胞)、 转基因动、植物,影响天然蛋白质类药物质量、产量和生产成本的因素:,(2)发育生长阶段,(1)种属,胸腺原料必须采自幼龄动物,一般从胎儿、胎猪或胎牛肝中获得,(3)生物状态 (4)原料来源,(5)原料解剖学部位 (6)对生物技术产品宿主菌或细胞的要求,胃粘膜总提取物、胃蛋白酶、凝乳酶、粘多糖,(二)蛋白质提纯的一般方法 分离依据: 分子量大小 溶解度 电荷 吸附性质 对其他分子的生物亲和力,等电点的概念 在一定pH环境中,某一种蛋白质解离成正、负离子的趋势相等,或解离成两性离子,其净电荷为零,此时环境的pH值即为该蛋白质

      2、的等电点,酸性,碱性,1、根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质 ,等电点时蛋白质的特性 性质比较稳定,物理性质如导电性、溶解度、粘度、渗透压等均最小 等电点的偏移 两性物质的等电点会因条件不同(不同离子强度、有机溶剂)而改变。 ,当盐存在时,pr若结合较多阳离子子,则PI向较高的pH偏移;反之,PI移向较低pH,根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质的方法: 等电点沉淀法 用等电点法沉淀蛋白质常需配合盐析操作,而除去不需要的杂蛋白时,常需配合热变性操作。 等电聚焦电泳 a. 分离蛋白质 b. 测定蛋白质的等电点,2、根据蛋白质分子形状和大小的不同来纯化蛋白质 蛋白质是生物大分子,不同种类蛋白质分子量大小不同. 方法:凝胶过滤法、超滤法、离心法及透析法 适用范围:蛋白质与其他小分子物质分离, 以及大小不同的蛋白质分离。 注意 用超滤法时,超滤膜截留分子量常与实际情况不一致。分子量相近的蛋白质由于在介质中有呈线形溶质或者是球形溶质的区别,可能出现不同的结果。(分子形状),凝胶过滤(体积排阻色谱),3、根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质 蛋白质溶解度的影响因素 溶液的pH 离子强度 溶剂的电解质性

      3、质 温度,根据蛋白质溶解度的不同来纯化蛋白质的方法: a, 盐溶与盐析法 硫酸铵分级沉淀 b, 结晶法 c, 低温有机溶剂沉淀法 常用溶剂:乙醇和丙酮,4、根据蛋白质电离性质的不同来纯化蛋白质 原理:利用离子交换剂为固定相,根据荷电溶质与离子交换剂之间静电作用力的差别进行溶质分离。 蛋白质的离子交换剂: 阴离子交换基:DEAE(二乙胺乙基)、QAE(季胺乙基) 阳离子交换基:CM(羧甲基)、SP(磺丙基)、P(膦酸基) 骨架材料:葡聚糖凝胶、琼脂糖、聚丙烯酰胺,纤维素 商品化离子交换剂:DEAE-Sephadex A-25,离子交换条件选择原则 1. 对已知等电点的物质,在pH高于其等电点时,用阴离子交换剂,在低于其等电点时,用阳离子交换剂。 2. 等电点未知的物质,可参照电泳结果 3. 若吸附太牢,可改用交换当量较小的交换剂或改变条件降低交换剂上带电基团的解离度,5、根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质 亲和层析法,即利用蛋白质分子能与其相应的配体进行特异的、非共价键的可逆性结合而达到纯化的目的。 固相化金属亲和层析(IMAC) 利用蛋白质分子中的咪唑基和巯基与一些金属元素(如Cu

      4、2、Zn2+等)形成配位结合,使蛋白质得到分离纯化。,6、根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化蛋白质 原理:蛋白质分子表面的疏水区与吸附剂上的疏水基团结合,再用洗脱剂(调节离子强度、极性、PH)将蛋白质洗脱下来。 方法:疏水性相互作用层析 应用:用含酚基疏水基团的琼脂糖纯化重组人表皮生长因子(rhEGF),纯度可达94%,回收率达82%。,7、根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质 常用吸附剂:结晶磷酸钙(羟灰石)、磷酸钙凝胶、硅胶、皂土沸石、硅藻土、活性白土、氧化铝以及活性炭等。 应用:催产素、胰岛素、HCG、HMG、细胞包素C等的纯化,8、根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质 逆流分溶:以化合物在两个不相溶的液相之间进行分配为基础的分离过程 应用:垂体激素、氨基酸、DNA等的纯化 。,9、根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质,二、多肽与蛋白质的化学合成,液相合成法 在有机溶剂中进行的均相反应,始于50年代 适用范围:分子量不太大的多肽(30肽以下) 缺点:合成分子量较大的蛋白质时,产物不能表现出全部活力且不能结晶,固相合成法 始于1962年 适用范围:小肽的合成(30肽

      5、以下) 缺点:对大分子的合成,还不能达到天然物质的全部活力(如124肽的核糖核酸酶) 。,多肽合成的几个主要步骤: 氨基保护和羧基活化; 羧基保护和氨基活化; 接肽和除去保护基团。,(一)基团保护,保护基必须具备的条件 (1)易在预定的部位引入 (2)易除去 (3)引入和除去保护基时,分子中的其它部位不会受到影响,特别是已接好的肽键。, 氨基保护剂: 苄氧羰酰氯(Cbz-Cl) 可用催化氢化法或钠氨法(用金属钠在液氨中处理)除去保护基 叔丁氧羰酰氯(BOC-Cl) 用稀盐酸或乙酸在室温除去保护基。,氯甲酸苄酯 Benzoxycarbonyl(简写Z), 羧基保护剂 种类:乙醇或甲醇 引入:无水乙醇或甲醇在盐酸存在下进行酯化,使羧基接上烷基。 脱除:常温下,氢氧化钠皂化法。, 侧链的保护 His咪唑基、Ser羟基、Tyr酚基、Cys巯基等的保护 保护剂:苄基(B2),钠氨法除去。 Glu和Asp的及-羧基的保护 保护剂:-及-苯甲酯,催化氢化法除去。 Arg胍基的保护 保护剂:对甲基磺酰基(Tos-)。,(二)肽的液相合成法 阶梯伸长法 片断缩合法,1. 阶梯伸长法,定义: 将带有R-O

      6、-CO-型保护基的氨基酸(不是肽)的羧基活化,从肽的C-端开始每次接上一个氨基酸,逐步递增的办法。 适用范围:合成比较小的肽或肽段 。 根据羧基活化方法不同,又分为:混合酸酐法和活化酯法,注意:一般采用羧基活化的方法,合成肽的常规方法是从C-端向N-端进行。(原因:活化氨基的反应激烈,且常常产生消旋化),活化酯法(带有氨基保护的氨基酸对硝基芳香族酯与另一氨基酸酯的氨基缩合成肽),DCC+N-端保护的Aa,(R1CO)2O,R2-NH2,R1-CO-NH-R2,混合酸酐法-DCC法:加入碳二亚胺缩合剂,H-Gly-OME,Z-Leu-OC6H4NO2,Z-Leu-Gly-OME,2. 片断缩合法 片断缩合法是由小肽缩合成大肽的方法,为避免消旋,常用叠氮法接肽。 优点:产品光学纯度高(不消旋)。,(三)肽的固相合成法 定义:在不溶性的聚苯乙烯树脂载体上进行肽链的延长。 过程: 1. C-末端的固定 合成多肽的C-末端先和氯甲基聚苯乙烯树脂(氯化苄酯树脂)反应形成苄酯 2.接肽 按肽链一级结构的顺序将氨基端已被保护的氨基酸逐个加上去,使肽链延长。,在多肽合成中通常采用氨基保护,羧基活化的方法

      7、,多肽固相合成原理的发明 1963年美国洛克菲勒大学教授 Robert. Bruce Merrifield发明了肽的固相合成法(BOC法), 成功地合成出了舒缓激肽(9肽)和具有124个氨基酸残基的核糖核酸酶 ,并因此于1984年获得了诺贝尔化学奖。,Robert. Bruce Merrifield (1921- May, 2006),固相法合成多肽反应示意图,羧基通过N,N-二环己基碳二亚胺(DCC, Dicyclohexylcarbodiimide)活化,BOC法固相合成多肽示意图,固相合成多肽的常用方法: t-BOC法 氨基用叔丁氧羰基保护,最后一步脱保护和水解应用强酸HF,条件苛刻,不适宜于短肽的大规模自动化合成 Fmoc法 现在大多采用Fmoc法(by R.C.Sheppard at Cambridge University) 氨基用9-芴甲氧羰基保护,最后一步脱保护和水解反应用弱酸TFA(三氟乙酸),条件温和,反应易监控。,9-芴甲氧羰酰氯,固相法合成多肽优点:最初的反应物和产物都是连接在固相载体上,故可在一个反应容器中进行所有的反应,大大减轻了每步产品提纯的难度,便于自动

      8、化操作,可获得高产率,产物易分离。 目前化学合成多肽可以在程序控制的自动化多肽合成仪上进行,研究型多肽合成仪,生产型多肽合成仪,中式型,中试型多肽合成仪,研究型多肽合成仪,固相法合成的多肽产品: 催产素(9肽)、促黄体生成素释放因子(LRH,9肽)、胸腺肽(5肽), 产量高,而且比天然产品好。,(四)游离肽的获得 分离纯化: 结晶法,层析法,等电点沉淀法,超滤法 产品干燥: 真空冷冻干燥或冷冻干燥(避免失活),第二节 多肽类药物,一、概述 活性多肽来源: 生物体的组织、细胞、体液等 人工合成 第一个人工合成的活性多肽催产素(1953年) 神经肽 ,细胞生长调节因子(60 、70年代 ) 酶催化 无活性的蛋白质前体酶加工剪切转化活性蛋白质、多肽, 多肽药物的种类 多肽激素 垂体多肽激素 、下丘脑激素 、 甲状腺激素、 胰岛 激素 、胸腺激素 多肽类细胞生长调节因子 表皮生长因子(EGF)、转移因子(TF)、心钠素(ANP) 含有多肽成分的其他生化药物 蜂毒(肽)、蛇毒(肽),二、主要多肽类药物的制备,(一)胸腺激素(Thymus hormones) 作用:对免疫功能(免疫缺陷病、自身免疫

      9、性疾病、恶性肿瘤以及老年性退化性病变)有多方面的影响。 用途:免疫调节剂,1、胸腺素(Thymocln) 来源:小牛胸腺 (1)结构和性质 1) 由4050种多肽组成的混合物 2) 80热稳定 3) 分子量在100015000之间 4) 等电点在 3.59.5之间。,根据等电点以及在等电聚焦分离时的顺序而命名,共分三个区域: 区:PI低于5.0的组分, 区:PI在5.07.0之间的组分, 区: PI在7.0以上者(此区内组分很少)。 有活性的称为胸腺素,如胸腺素1, 无活性的称之为多肽,如多肽1。,(2)生产工艺:,除杂蛋白:热变性法(要求目标蛋白有较高的热稳定性) 沉淀: -10丙酮,避免有机溶剂引起蛋白失活 硫酸铵分级沉淀:2550饱和度 超滤:取透过液(MW1.5万) 脱盐:Sephadex G-25 凝胶过滤,2、胸腺肽(Thymus peptides) (1)结构和性质: 来源:冷冻的小牛(或猪、羊)胸腺 组成: 1)分子量9600和7000左右的两类蛋白质或肽类 2)氨基酸15种,RNA 、DNA 性质: 对热较稳定,加温80生物活性不降低。 经蛋白水解酶作用,生物活性消失。,(2)生产工艺:,原料预处理:除脂(剪刀减去脂肪、筋膜) 水提:冷水 热变性除杂蛋白 超滤:目蛋白分子量 9600和7000 精制液分装前,需微孔滤膜除菌过滤,(3)作用与用途: 胸腺肽可调节细胞免疫功能,有较好的抗衰老和抗病毒作用。无过敏反应和不良的副作用。,(二)促皮质素(Adrenocorticotropic hormone,ACTH) 1结构和性质: 来源:垂体前叶 溶解性:溶于水,能溶解于70%的丙酮或70的乙醇。 等电点:6.6。 稳定性:在干燥和酸性溶液中较稳定,耐100;在碱性溶液中容易失活。,2、生产工艺,(促皮质素),CMC离子交换吸附(羧甲基纤维素 弱酸型 阳离子):静态吸附 (投料量的20%) 二次吸附前,解析液用71

      《生物制药课件(第五章)》由会员F****n分享,可在线阅读,更多相关《生物制药课件(第五章)》请在金锄头文库上搜索。

      点击阅读更多内容
    最新标签
    发车时刻表 长途客运 入党志愿书填写模板精品 庆祝建党101周年多体裁诗歌朗诵素材汇编10篇唯一微庆祝 智能家居系统本科论文 心得感悟 雁楠中学 20230513224122 2022 公安主题党日 部编版四年级第三单元综合性学习课件 机关事务中心2022年全面依法治区工作总结及来年工作安排 入党积极分子自我推荐 世界水日ppt 关于构建更高水平的全民健身公共服务体系的意见 空气单元分析 哈里德课件 2022年乡村振兴驻村工作计划 空气教材分析 五年级下册科学教材分析 退役军人事务局季度工作总结 集装箱房合同 2021年财务报表 2022年继续教育公需课 2022年公需课 2022年日历每月一张 名词性从句在写作中的应用 局域网技术与局域网组建 施工网格 薪资体系 运维实施方案 硫酸安全技术 柔韧训练 既有居住建筑节能改造技术规程 建筑工地疫情防控 大型工程技术风险 磷酸二氢钾 2022年小学三年级语文下册教学总结例文 少儿美术-小花 2022年环保倡议书模板六篇 2022年监理辞职报告精选 2022年畅想未来记叙文精品 企业信息化建设与管理课程实验指导书范本 草房子读后感-第1篇 小数乘整数教学PPT课件人教版五年级数学上册 2022年教师个人工作计划范本-工作计划 国学小名士经典诵读电视大赛观后感诵读经典传承美德 医疗质量管理制度 2 2022年小学体育教师学期工作总结 2022年家长会心得体会集合15篇
    关于金锄头网 - 版权申诉 - 免责声明 - 诚邀英才 - 联系我们
    手机版 | 川公网安备 51140202000112号 | 经营许可证(蜀ICP备13022795号)
    ©2008-2016 by Sichuan Goldhoe Inc. All Rights Reserved.