免疫荧光技术（修改后）

1、免疫标记技术,用可以微量检测的标记物（示踪物质）标记抗原或抗体，作为试剂，与相应抗体或抗原结合反应后，测定抗原抗体复合物中的标记物，从而推断所测抗体或抗原有无及量的多少。,免疫标记技术 =,免疫技术+ 标记技术,酶,荧光素,同位素,常 用 标 记 物 荧光素 酶 同位素 胶体金 可发光化学物质,试验命名： 根据标记物命名 如：免疫荧光技术 免疫酶技术等,免疫荧光技术 （ Immunological fluorescent technique，IF),原理： 用荧光素标记抗原或抗体，与待测标本中相应抗体或抗原结合，通过检测荧光，确定标本中有无待测的抗体或抗原。,免疫荧光技术分类： 免疫荧光显微技术（定性） 免疫荧光测定技术（定量）,一.荧光、荧光素及荧光显微镜,（一）荧光 一种光照射某种物质时，该 物质可发出比照射光波长更长的 光称为荧光。 照射光:可见光、紫外光,(二）荧光素 能产生荧光的物质，可作为染料。,常用荧光素： 1.异硫氰酸荧光黄(FITC) 可发出黄绿色荧光,2.四乙基罗丹明（RB200) 发出橘红色荧光,3.藻红蛋白（PE） 发出橙色荧光,（三）荧光显微镜 1.结构：主要

2、组成 A.白炽光源（超高压汞灯）：发射紫外光或兰 紫光； B.两组滤光板:激发滤板（选择合适的激发光谱）；抑制滤板（抑制紫外光或兰紫光进入视野，只允许荧光通过。 C.显微镜：普通的光学显微镜。,光路程序： 白炽光源 发射紫外光or兰紫光 激发滤板 紫外光 被检物（荧光染色标本）紫外光荧光 抑制滤板荧光（显微镜下可见）,目镜,阻挡滤镜,载玻片,荧光显微镜光路示意图,光源,隔热滤片,激发滤片,聚光器,物镜,荧光显微镜光路示意图,荧光显微镜据光源路径分 透射式（光源从下面经聚光器会聚后到达样品，适用于观察对光可透的标本） 落射式（光源从上面到达样品，经标本反射进入物镜。适用于观察透明度不好的标本及各种活性组织等）,2.使用注意事项： 染色后立即检查（荧光易猝灭） 准备好后开启白炽光源，不能随时启灭。打开后15分钟才能关闭 每次使用2小时 保持室内通风,荧光素可以标记（染色）抗原，也可以标记抗体 标记抗原 用得少 标记抗体 用得多 一般免疫荧光显微技术均标记抗体,二.免疫荧光显微技术 （一）荧光抗体的制备 （二）片子的制作 （三）荧光抗体染色方法,（一）荧光抗体的制备： 纯化的一定量抗体 加一

3、定量 FITC(搅拌使结合） 去除游离荧 光素 测抗体效价、测荧光素 与蛋白质（Ab）结合比（F/P） 小量分装保存备用,（二）片子的制作： 1.常做切片、涂片、印片，要求薄、均匀，并与玻片充分固定。固定后不能被洗脱。 2.注意保持抗原完整性 3.不同材料固定方法不同（无水已醇、丙醇、聚甲醛等）,（三）荧光抗体染色法,1.直接法 待测标本固定（Ag？） + Ab,快、直接、干扰因素少 用于检测抗原 每检测一种抗原需标记相应的荧光抗体,较麻烦,洗涤，,AgAb,2.间接法 分两步： 第一步：荧光素标记抗抗体（如荧光 标记的羊抗人IgG）； 第二步：已知Ag固定待测标本（Ab？）洗涤，荧光标记的 抗抗体洗涤，荧光显微镜镜检,间接法用得最多 优点： 制备一种荧光标记二抗（抗抗体）可用于多种Ab检测 灵敏度高,3.补体法： 第一步：荧光素标记抗补体； 第二步：已知Ag固定待测标本（Ab？）补体洗涤，荧光标记的抗补体洗涤，荧光显微镜镜检,特点： 灵敏度高，制备一种荧光抗补体用于多 种检测 干扰因素多，补体不稳定，易失活， 该法少用,4.双标记法 用两种荧光素（FITC、罗丹明）分别标记针对同一A

4、g上不同抗原表位的抗体，对同一标本染色，当Ag有两种相应抗原表位存在时，可同时见到黄绿和橙红两种荧光。,（四）免疫荧光显微技术优缺点 优点： 1.特异性、敏感性高 2.快速 3.可定位 4.既可测Ag又可测Ab,缺点： 1.需要荧光显微镜 2.存在非特异荧光干扰（产生原因：自发、抗体不纯、交叉反应、技术问题） 3.定性测定、判断结果不客观 4.制备的片子难以长期保存（荧光猝灭）,三.时间分辨荧光免疫测定 （液相检测） 原理： 用铕(Eu)等具有较长荧光寿命的稀土金属作荧光标记物来标记Ab或Ag ，从而检测待测标本中相应Ag或Ab的新技术。 其特点是：利用时间分辨荧光仪延缓检测时间，排除非特异性干扰荧光。 灵敏度可达0.2 1 ng/ml。,思考题： 1.免疫标记技术的原理 2.免疫荧光技术中最常用的荧光素是什么？ 3.免疫荧光显微染色的各种方法及优缺点,免疫酶技术 Immunoenzyme technique,概述： 70年代初在免疫荧光技术基础上建立。 较IF、RIA(radioimmunoassay)更优 越 , 具有敏感、安全、稳定、易观察结果等优点,原理： 利用酶标记Ag或Ab

5、后不改变Ag、Ab反应特异性，同时又不影响酶的活性，结合在AgAb上的酶催化底物，生成有色产物，根据产物颜色深浅推测出待测物中相应物质（Ab、Ag)有无及含量多少。 Ag + AbE AgAbE + 底物 呈色反应,免疫酶技术具有 特异性 Ag、Ab反应 敏感性 酶的高效催化作用,两种方法:,酶免疫组织化学染色技术（免疫组化） 酶免疫测定法（酶联免疫吸附实验，Enzyme-Linked immunosorbent assay,ELISA),常用的酶 （一）选择酶的要求 1.自然界存在广，易获得 2.易纯化、性稳、活力高 3.形成的酶结合物稳定，并保留酶、 抗体或抗原的活性,4.底物来源方便并易保存 5.反应后有色产物能快速测定 6.酶分子量不能太大，太大不易进入组织细胞内，影响组化染色定位,（二）常用的酶 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶等,辣根过氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP) 一种铁卟啉蛋白质，分子量4.4万，能进入细胞内 酶活性强，酶结合物可长期保存 最适pH为5.5左右,选用时注意酶纯度和活性 纯度：RZ表示，反映酶含量与蛋白含量之比，

6、最好要RZ值为3.0左右 活性：每1mg酶中所具有的活性单位，应大于250u/mg,HRP的底物： 邻苯二胺(OPD),四甲基联苯胺（TMB） 反应体系中作为供氢体 DH2+H2O2 D+2H2O 供氢体 受氢体 有色产物,HRP,OPD特点： 有色产物为黄色 空白对照接近无色 敏感度高，有致癌作用 TMB特点： 有色产物为蓝色 无致癌作用,底物系统（包括供氢体、 受氢体） 临用时配，配后避光保存,酶联免疫吸附实验 （Enzyme-Linked immunosorbent assay） ELISA,一.原理： 将酶分子与Ab或Ag连接成一酶结合物（酶标记物），当它与固相载体中相应Ag或Ab相遇，形成酶标记的AgAb复合物，加入底物，酶催化底物，生成有色产物，根据颜色深浅可测出溶液中Ag或Ab的量。,固相载体,聚苯乙烯,Ag或Ab吸附到固相载体上的过程,称为包被,(酶免疫测定法),实验中所需酶标抗体的制备方法同荧光抗体制备： 纯化后的抗体+酶 透析去除游离酶 测定酶标抗体工作浓度,试验中有关术语及试剂： 包被(coat)：将Ag或Ab吸附在固相载体上的过程，又称固相化或吸附。包被后，不能

7、被洗脱。包被缓冲液：PH9.6 CB 洗涤(wash)：PH7.2-7.4 PBS 酶结合物 ：酶标抗体或酶标抗原 终止液：2M H2SO4,OPD： HRP催化后其有色产物为黄色，H2SO4终止后变为橙色（棕色）。 TMB： HRP催化后其有色产物为蓝色， H2SO4终止后变为黄色,二.方法类型和操作步骤 （一）双抗体夹心法,双抗体夹心法步骤： 包被已知Ab 洗涤 加待测标本（测Ag？） 洗涤 加酶标Ab 洗涤 加底物 加终止液 观察结果,双抗体夹心法的基本实验过程,洗涤三次,终止液,该法主要用于检测抗原 包被的抗体与酶标抗体属同一种类抗体 每检测一种抗原就需制备相应的酶标抗体，较麻烦,（二）间接法测抗体,步骤： 包被已知Ag待测标本（测Ab？） 反应一段时间后，洗涤加酶标抗抗体（酶标羊抗人IgG）洗涤加底物加终止液 ，观察结果。,该法主要用于测抗体 酶标记一种抗抗体可以用于多种抗 体的检测,包被抗体,加标本（抗原）,加抗体,加酶标抗抗体,间接法测抗原,（三）双位点一步法,步骤：包被抗体A待测标本 酶标抗体B 洗涤，底物终止液，观察结果 （检测Ag，Ag至少含A、B两个抗原表位）,该

8、法是一次性加入标本和酶标抗体，试 验程序简单，提高了检测的特异性 用于检测Ag , 且Ag是具有至少2种抗原表 位的多价抗原 反应系统中固相Ab与酶标Ab的量相对于待测Ag是过量的，因此复合物的形成量与待测Ag含量成正比（在方法可检测范围内）,（四）竞 争 法,步骤： 待测管：已知Ab包被待测标本（Ag？） 洗涤，酶标Ag洗涤，底物显色,先加,先加,（五）应用亲和素和生物 素的ELISA,亲和素(avidin)：糖蛋白，一分子由四个亚基组成，每一亚基可以与一分子生物素结合 生物素(biotin)：维生素H，可与蛋白质、糖类、酶类等结合，与亲和素特异结合后极稳定,亲和素,生物素,生物素,生物素,生物素,亲和素 生物素在ELISA中使用：,三.ELISA结果的判定 （一）肉眼判定 与阳性、阴性对照颜色比较：,结果判定,2.若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判 定为阳性；,3.若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照 孔之间则判定为弱阳性。,1.若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性；,（二）酶标光度仪检测A492值 （吸光率）：比色法 1.与阳性、阴性对照测定值比较 2.P/N比值：大于2.0为

9、阳性，小于2.0 为阴性 P: positive（待测吸光度值） N: negative,四.ELISA试验的影响因素 （一）固相载体 常用固相载体材料：聚苯乙烯。其特点为吸附Ag或Ab的能力强，一但吸附后，不能被洗脱。 固相载体：酶标板 可分软、硬板 一次性使用，不可回收,酶标板要求： 吸附性能好、空白值低、透明度高 板批间、孔间性能相近,（二）抗原、抗体 Ag：需纯化 Ab：需效价高、亲和力强、纯化,（三）试验条件 1.包被： 一般用pH 9.6 CB(carbonate buffer)，0.05M, 有利于蛋白质吸附,包被浓度：0.1100g/ml，一般常用10 g/ml 包被时间、温度：4 过夜或37 1-3h 包被量：100ul 封闭：用0.15% 牛血清白蛋白缓冲液浸泡 0.5小时,2.抗原抗体反应的条件 （1）微碱性有利于抗原抗体结合，故用pH 7.4 PBS(phosphate buffer saline)洗涤 （2）去污剂有利于AgAb形成，洗液中加0.05% Tween-20 （3）Ag、Ab反应时间、温度： 一般 37、3040min,3.洗涤 采用 PH7.2-7.4PBS洗涤，规一化，每次浸泡12min，拍干，共洗涤34次,4.酶促反应条件 温度 37 时间 10min pH 5.5 底物量 一致,5.排除干扰：多设 对 照,ELISA试验应设对照 应设对照 操 作 应得结果 阳性对照 同标本一样 颜色深 阴性对照 同标本一样 颜色浅or无色 酶结合物对照 加酶步加入 无色 底物 对照 加底物步加入 无色 空白对照 只加终止液 无色,（以间接法为例，每孔

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