转化与扩增课件

1、第二章 分子克隆单元操作,2.2,2.3,2.1,克隆载体,DNA的体外重组（切与接）,目的基因的克隆,2.4,转化与扩增（转与增）,转化子的筛选与重组子的鉴定（检）,2.5,基因工程的操作过程,切,接,转,增,检,一、用于基因转移的受体（宿主） 二、转化与扩增,2.3 转化与扩增,一、用于基因转移的受体（宿主）,分子克隆用宿主应具备的条件 各种基因工程受体（宿主）的特性 实验室常用的基因工程受体,1、分子克隆用宿主应具备的条件,限制性缺陷型,外切酶和内切酶活性缺陷（hsdR-）,重组整合缺陷型,用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA- ， recB-，recC- ）,具有较高的转化效率,具有与载体选择标记互补的表型,感染寄生缺陷型,防止重组细菌扩散污染，生物武器除外,野生型细菌一般不能作为受体细胞，需要进行改造,基因工程主要宿主系统,原核细胞(Prokaryotic),真菌（Fungus ),昆虫(Baculovirus ),高等真核细胞（Eukaryotic),人（基因治疗）,动、植物（基因农场）,2、各种基因工程受体（宿主）的特性,1）大肠杆菌,遗传背景清楚，载体受体系统完备

2、，生长迅速，培养简单，重组子稳定。,适用于外源DNA的扩增和克隆、基因文库的构建和外源基因的高效表达，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。,产生结构复杂、种类繁多的内毒素。,各种基因工程受体的特性,2）枯草芽孢杆菌,遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全 ，生长迅速，培养简单，不产内毒素,适用于重组蛋白与多肽、特别是微生物来源的酶的高效分泌表达，。,遗传欠稳定，载体受体系统欠完备,各种基因工程受体的特性,3）链霉菌,抗生素的主要生产者，相对操作简便，不产内毒素,主要用于抗生素生产菌株的改良,遗传不稳定，生长相对缓慢,各种基因工程受体的特性,4）酵母菌,具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定,适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌,内源性蛋白产物种类繁多且含量高,各种基因工程受体的特性,5）昆虫细胞（家蚕，杆状病毒表达系统）,具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定,适用于真核生物基因的高效表达,DNA重组

3、操作系统欠完善,各种基因工程受体的特性,6）哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO）,与人的亲缘关系近，表达系统完善，具有合适的糖基化修饰系统,适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体,细胞培养条件苛刻，生长缓慢,各种基因工程受体的特性,7）植物细胞（拟南芥菜、烟叶）,农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用,适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良,遗传操作繁琐,3、实验室常用的基因工程受体（宿主）,大肠杆菌,用于接受质粒：C600、W3110、HB101、JM83、DH5、 JM101（Aps、Tcs、Cms） 用于接受l-DNA：LE392、ED8654,真菌,哺乳动物细胞 CHO,毕赤酵母、汉森酵母、,啤酒酵母,酵母菌：,丝状真菌：黑曲霉、青霉,二、转化和扩增（转与增）,转化的原理与技术,转化率,转化细胞的扩增,几个基本概念,感受态（compentent )： 受体(宿主）细胞经过一些理化或生物学方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性的改变，成为能允许外

4、源DNA进入的一种生理状态。感受态细胞（compentent cell ),转化（transformation )： 外源DNA导入特定受体（宿主）细胞，并使之繁殖和表达的操作。,转化子（transformant)： 经转化而带有外源DNA的受体（宿主）细胞。,重组子（recombinant)： 含有重组DNA的转化子。相对于仅含空载体的转化子而言。,1、转化的原理与技术,Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化（Ca2+法）,细菌原生质体的转化（原生质体法）,完整细菌细胞的电穿孔转化（电转化法）,l噬菌体DNA的转染,1）Ca2+诱导的完整细菌细胞的转化,Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，转化混合物中的DNA与其形成抗Dnase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态即为感受态 。,大肠杆菌感受态细胞的制备：,100 ml 菌体培养至OD600 = 0.5，离心收集菌体,用10 ml 冰冷的10 mM CaCl2溶液悬浮菌体，离心

5、,用1 ml 冰冷的75 mM CaCl2溶液悬浮菌体,冰浴放置12 - 24小时，备用,收集菌体,大肠杆菌感受态细胞的质粒转化：,取100 ml 感受态细胞，加入相当于50 ng 载体的重组,冰浴放置半小时,在42保温 90秒（热脉冲）,快速将转化细胞转移至冰浴中放置1 - 2分钟,DNA连接液，混匀,加入1 ml 新鲜培养基，于37培养 1 小时（扩增）,涂在合适的固体培养基平板上进行筛选,2）细菌原生质体的转化,革兰氏阳性细菌（如枯草杆菌、链霉菌等）接纳外源DNA的主要屏障是细胞壁，因而这类细菌通常采用原生质体（细胞去壁后的形态）转化的方法转移质粒或重组DNA分子,酵母菌、霉菌、植物细胞也可用原生质体法进行转化,不同细菌的原生质体制备方法不尽相同，以链霉菌为例：细菌需生长在高渗培养基中（如34%的蔗糖溶液，并加入甘氨酸以增加细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性。在制备过程中，菌体应始终悬浮在10.3%的蔗糖等渗溶液中。与原生质体接触的所有器皿应保持无水无去污剂,细菌原生质体的制备：,取0.2 - 1ml的原生质体悬浮液（108-109个原生质体），加入10 - 20 ml DNA重组连接液

6、，同时加入含有PEG1000和Ca2+的等渗溶液，混匀,细菌原生质体的转化：,细菌原生质体的再生：,原生质体再生的主要目的是使细菌重新长出细胞壁。再生在特殊的固体培养基上进行，内含脯氨酸和微量元素,3）电穿孔转化,将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场。在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内 电穿孔转化法操作简单，而且几乎对所有含细胞壁结构的受体细胞均有效，但转化效率差别很大 同样的原理，电穿孔法也可用于质粒消除实验,4）l噬菌体DNA的转染,感受态细胞的培养： 将大肠杆菌在含有麦芽糖（不含葡萄糖）和MgCl2的培养基 中培养至OD600 = 0.5 吸附： 加入经体外包装好的重组噬菌体悬浮液，30保温10分钟 转染裂解： 加入20倍体积的新鲜培养基，30培养2小时，直至培养液 中菌体裂解，培养液澄清度增加，然后涂板筛选,2、转化率,转化率的定义,每微克DNA分子转化宿主菌能获得的转化子数。 例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。一微克pUC18共

7、有3.4X1011个分子（6.02X1017 / 2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞 另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18 DNA,转化率的用途,利用转化率和重组率等参数可以帮助设计DNA重组实验规模,例如，某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107/mg载体，,经切接处理后的载体转化率比天然的载体低100倍，欲获得104个,重组克隆，需投入多少载体DNA进行重组实验？,若重组率为100%，则转化后产生104个重组克隆需要：,104 / 107 X 10 - 2 = 0.1 mg 载体DNA,考虑到实验系统的重组率为20%，所以实际投入载体应为：,0.1 / 20% = 0.5 mg 载体DNA,转化率的影响因素,载体及DNA重组分子方面：,载体本身的性质：,不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同,载体的空间构象：,质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载,体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制

8、备的,超螺旋质粒低两个数量级,插入片段的大小：,对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低,转化率的影响因素,受体细胞方面：,受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高,转化方法方面：,受体细胞的预处理：影响最大,供受体的比例：,Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA,转化方法：,Ca2+诱导转化 106 - 107 / mg DNA,原生质体转化 109 个原生质体 50 ng DNA,原生质体转化 105 - 106 / mg DNA,l-DNA转染 107 - 108 / mg DNA,电穿孔转化 106 - 109 / mg DNA,3、转化细胞的扩增,扩增操作,转化细胞的扩增操作是指转化完成之后细胞的短时间培养。在实验时，扩增操作往往与转化操作偶联在一起，如： Ca2+诱导转化后的37培养一个小时 原生质体转化后的再生过程 l噬菌体转染后的30培养等，均属扩增操作,扩增操作的目的,增殖转化细胞，使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序,使载体分子上的标记基因扩增和表达，便于筛选,

9、表达外源基因，便于筛选和鉴定,第二章 分子克隆单元操作,2.2,2.3,2.1,克隆载体,DNA的体外重组（切与接）,目的基因的克隆,2.4,转化与扩增（转与增）,转化子的筛选与重组子的鉴定（检）,2.5,基因工程的操作过程,切,接,转,增,检,转化子的筛选和鉴定的必要性,由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子,转化子,重组子,目的重组子,经转化扩增单元操作后的受体细胞总数（包括转化子与非转化子）已达 1091010，需要从中选出期望重组子,概念,转化子筛选和鉴定流程,1、筛选 选择性平板筛选,转化子,重组子,目的重组子,非转化子,2、重组子初步鉴定 显色、PCR、比大小、酶切、分子杂交、生物/免疫学活性,3、重组子确证 DNA序列分析,4、外源基因表达产物检测 仅当外源基因克隆于特定表达载体和宿主中时才需要。常规基因克隆则否。,1、抗药性筛选法,ROP,ROI,Sal I,BamH I,Tc,r,Pvu I,Pst I,Pst I,EcoR I,Cla I,Hind III,Hind II,Bal I,Ap,r,绝大多数载体的抗性标记用于筛选转化子， 但pBR322可筛选重组子：,pBR322,4363 bp,ori,

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