梅毒螺旋体实验室检验课件

1、灌南县第一人民医院检验科 金建怀 2016年6月17日,梅毒的实验室诊断,概述,梅毒及其病原学特征 梅毒流行状况 梅毒实验室诊断 暗视野显微镜检查及临床意义 梅毒血清学检查及临床意义 梅毒检测试剂评估 梅毒诊断标准知识要点与报告要求,梅毒及其病原学特征,梅毒 syphilis,梅毒（syphilis）是由梅毒螺旋体（treponema pallidum）引起的主要通过性接触或血液传播，侵犯多系统多脏器的全身性慢性传染病。 临床症状复杂,时隐时现 传染途径:性传播,垂直传播,其它途径,梅毒螺旋体特征,有612个规则的螺旋 螺旋整齐，数目固定 折光性强，较其他螺旋体亮 运动缓慢而有规律，有三种运动方式 围绕其长轴旋转运动 伸缩其螺旋间距离移动 弯曲扭动如蛇行,暗视野梅毒螺旋体,梅毒螺旋体,荧光法检查梅毒螺旋体,梅毒螺旋体特征,人是梅毒螺旋体的唯一自然宿主 梅毒螺旋体不能在体外培养繁殖 最适生存温度是37，离开人体很快死亡 梅毒螺旋体属厌氧微生物，耐寒能力强。煮沸、干燥、肥皂水及一般消毒剂均可短期内将其杀死,梅毒螺旋体致病性,致病物质：荚膜样物质、粘多糖酶 所致疾病梅毒 后天梅毒经性接触传染

2、 临床分期 一期梅毒：外生殖器硬性下疳 二期梅毒：全身梅毒疹 三期梅毒：皮肤粘膜溃疡、侵犯内脏器官或组织 隐性梅毒：无任何梅毒性的症状和体征 先天梅毒经胎盘传给胎儿 胎儿表现为流产、死胎 出生后表现为锯齿形牙、鞍形鼻等,2010年全国梅毒疫情地区分布,发病率位于前5位： 浙江：97.13/10万 广西：82.58/10万 上海：75.93/10万 福建：58.23/10万 新疆：52.97/10万,2010年全国梅毒疫情年龄与性别分布,男女性别比：0.941 15-39岁：女性多于男性 40岁以上：男性多于女性,标本采集部位： 皮肤或粘膜损害 有痂者去痂，先用无菌棉球或纱布蘸生理盐水，将皮损拭净，轻压皮损至渗液（避免出血）。然后用载玻片印取渗液，立即检查，未破溃者用手术刀刮破皮疹，取渗出液。 淋巴结穿刺液 以无菌操作法用注射器吸取0.25-0.5ml生理盐水，穿刺入淋巴结，再回吸23次，最后将吸取液涂玻片上，立即检查。,梅毒暗视野采样,暗视野显微镜检查,制片 标本置于载玻片上，加一滴生理盐水，盖上盖玻片，在暗室中于暗视野显微镜上油镜观察 观察 先用低倍镜，再转至高倍镜 梅毒螺旋体在暗背

3、景上呈白色发光，螺旋整齐，运动规律（旋转、伸缩或蛇行运动）,暗视野显微镜检查,结果解释阳性 暗视野显微镜查阳性，临床上可确诊梅毒 特别对一期梅毒硬下疳，肿大淋巴结，二期梅毒皮肤粘膜损害的诊断有重要价值，尤其使用于早期梅毒血清学阴性时,暗视野显微镜检查,结果解释阴性 阴性结果不能排除梅毒 螺旋体数量不足 已用过抗生素或某些外用药 损害接近自然消退 损害不是梅毒 检验人员技术,暗视野显微镜检查,特点 该方法具有快速、方便、可靠的特点，已被WHO确定为性病实验室必备项目之一 口腔中含有其他密螺旋体，与梅毒螺旋体不易区别，暗视野显微镜查不推荐于口腔皮损材料,梅毒血清学检查,血清学方法是诊断各期梅毒的主要方法，包括： 非特异性血清学试验（非梅毒螺旋体抗原血清试验） 用于初筛试验、疗效观察。 特异性血清学试验（梅毒螺旋体抗原血清试验） 用于确证试验，对疗效观察意义不大。 局限性：非常早期的梅毒可能出现阴性，还需做病原体检查。,国内梅毒血清学试验的传统程序是： 先以非梅毒螺旋体抗原血清试验（如RPR、TRUST、VDRL等）进行初筛，再以梅毒螺旋体抗原血清试验（如TPPA、TPHA、FTA-ABS等

4、）进行确认。 美国、法国和比利时也采用类似的程序。 该程序的优点是排除了大多数感染过梅毒但经过充分治疗的病人，从而使临床更易决定是否需要进行抗梅治疗。,将梅毒螺旋体抗原血清试验和非梅毒螺旋体抗原血清试验组合在一起（如RPR+TPHA或TPPA）作为初筛试验可以最大限度地检出各期梅毒病例（除一期梅毒的极早期），同时保证了敏感性和特异性，是最为理想的梅毒初筛方案。 这是世界卫生组织（WHO）推荐的方案，英国等一些欧洲国家也已采用多年。其缺点是费时费力，实验室的工作量较大。,梅毒的确认必须采用特异性梅毒螺旋体抗原血清试验，最常用的是TPPA或TPHA，也可采用ELISA。 FTA-ABS仍被认为是梅毒血清学测定的“金标准”，但使用上有很大限制。多数实验室无法常规开展，因此一般只用于对有争议标本的检测。 如果仅使用非梅毒螺旋体抗原血清试验进行初筛，则可以用任意一种梅毒螺旋体抗原血清试验做确认；如果在初筛时已使用了梅毒螺旋体抗原血清试验，则可以考虑选用另一方法学的梅毒螺旋体抗原血清试验进行确认（例如在初筛时使用了TPPA或TPHA，则可用ELISA进行确认，反之亦然）。,非梅毒螺旋体抗原血清试验

5、,本法主要检测抗梅毒螺旋体细胞膜上脂类的IgG和IgM抗体。 原理：人体感染梅毒螺旋体后，组织破坏所释放的类脂，与梅毒螺旋体结合后形成完全抗原，刺激机体产生类脂质抗体（反应素）。 主要为IgG，IgM的混合抗体,非梅毒螺旋体抗原血清试验,已知抗原：心磷脂、卵磷脂及胆固醇 检测成分：血清梅毒反应素 方法： 性病研究实验室玻片试验（VDRL） 血清不需加热的反应素玻片试验（USR） 快速血浆反应素环状卡片试验（RPR） 甲苯胺红血清不需加热试验（TRUST）,RPR/TRUST,原理: RPR:以黑色的炭颗粒作为指示标记物 TRUST:以红色的甲苯胺红颗粒作为指示标记物 检测成分：血清梅毒反应素,RPR/TRUST,定性试验 在纸卡圆圈中加入50L待检血清，涂满整个圆圈 使用滴管和专用针头，加1滴混匀的抗原悬液 旋转100rpm，8min 立即判断结果,RPR/TRUST,结果判断 阳性：在圆圈中见不规则大小黑色/红色凝集块 阴性：在圆圈中无黑色/红色凝集块，仅见黑色/红色颗粒集于中央一点或均匀分散。,非梅毒螺旋体抗原血清试验的优缺点： 优点： *敏感性特异性好 *不需要昂贵设备，简单易行

6、 *适用于大量人群的血清筛查 *有效治疗后血清滴度可下降并阴转，故可作疗效观察、判愈、复发。 *20分钟可获得实验结果。 *试剂与方法均已标化，各实验室间结果可比较。 *试验可被内部质控和外部质控监控进行。 缺点： *敏感性和特异性低于螺旋体抗原试验，BFP反应和前带现象,浑浊,（定性）,RPR/TRUST,定量试验 待检血清用等渗盐水在纸卡圆圈中作梯度稀释： 原血清，1:2，1:4，1:8，1:16，1:32 按定性试验步骤操作，以出现阳性反应的最高稀释度报告结果,（倍比稀释）,RPR/TRUST,注意事项： 实验环境温度应为：23-29 抗原应保存于4 冰箱，实验前应恢复到室温。 抗原应防止冻结。 血液标本实验前应恢复到室温，并在24小时内完成检测。 试验完毕应立即观察结果。,RPR/TRUST,假阴性 有25%-40%的未治疗梅毒在晚期隐性期可自然逆转为阴性，约30%的心血管和神经梅毒呈阴性 前带现象：抗原抗体量比例不适，抑制阳性反应。一般易发生在滴度在1：500以上的标本中。 1%的II期梅毒会出现前带现象 操作人员应注意实验的温度，试剂盒从冰箱取出后应恢复至室温，室温过低（1

7、0）可能出现假阴性或结果不准确（即使出阳性结果，试验滴度也不准）。,RPR/TRUST,生物学假阳性： 急性或慢性传染病：风疹、麻疹、水痘、疟疾、上呼吸道感染、病毒性肝炎，活动性肺结核、麻风，肺炎球菌性肺炎等； 其它疾病：SLE、类风湿性关节炎、风心病、DLE、肝硬化、慢性肾炎、系统性硬化症、自身免疫性溶血性贫血等； 身体状况改变：麻醉剂成瘾、妊娠、年老等 一般假阳性血清抗体滴度1：8 应排除技术性、生理性和生物学假阳性，并用特异性试验来证实,梅毒螺旋体抗原血清试验,已知抗原：梅毒螺旋体抗原 检测成分：抗梅毒螺旋体抗体 方法： 1.荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS） 2.梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA） 3.梅毒螺旋体颗粒凝集试验（TPPA） 4.梅毒螺旋体ELISA试验 5.快速试验（胶体金）,TPPA,原理： 用整菌和其片断做抗原致敏的明胶颗粒，此致敏颗粒与人血清或血浆中的梅毒螺旋体抗体结合，产生肉眼可见的凝集反应 敏感性和特异性均高 敏感性：一期梅毒：70%-100%， 二期梅毒：100% 三期梅毒95%-98% 特异性：94%-100% 容许做梅毒的精确诊断,TPPA,

8、原理示意图,明胶颗粒,抗原,TPPA,材料 U型板 、微量加样器（25ul）、振荡器 TPPA试剂盒(溶解液，样本稀释液, 致敏颗粒, 非致敏颗粒,质控血清,专用滴管）,方法,TPPA,结果判断 阴性():颗粒沉积在孔底,周边平滑,或形成致密圆圈 可疑反应():明胶颗粒沉积在孔底,中央形成致密小环, 周边平滑 阳性(+/+):内有清晰的宽环且外缘粗糙 强阳性(+/ +):孔内凝聚颗粒形成均一的膜覆盖在整 个孔底者 孔内样品与致敏和非致敏颗粒均产生凝集者,则需作重吸收试验后进一步检测,TPPA,TPPA,TPPA,注意事项 专用滴管应标明不能混用，不能用来稀释血清。 未致敏孔不发生凝集，否则试验无效。如果标本与非致敏和致敏颗粒均产生凝集，需作重吸收试验。 反应板要清洁干净，孔内无异物。 试剂保存于210，不可冻结，不同批号试剂间不可混用,其它常用确证方法,梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验（ELISA） 快速检测试剂（胶体金）,梅毒血清学检查临床意义,非特异性血清学试验阳性可能表示： 现症感染、接受或未接受过治疗的近期感染 可用于疗效观察、判愈、判定复发及再感染 早期梅毒患者经充分治疗后，滴度逐

9、渐下降，半年到2年大部分非特异性血清学试验阴转 可能有生物学假阳性(滴度常1:8） 适用于人群筛查、产前检查及健康体检,梅毒血清学检查临床意义,特异性血清学试验阳性结果表示 现症感染 接受或末接受过治疗的近期感染 既往曾经感染 特异性血清学试验因其敏感性高，特异性强，可作为证实试验及排除假阳性。特别是隐性梅毒及一些非梅毒螺旋体抗原血清试验阴性而又怀疑为梅毒的患者。 在多数情况下，一旦感染了梅毒，特异性血清学试验抗体阳性可保持数年，甚至终生阳性，故定性的特异性血清学试验不能用于观察疗效、判断复发及再感染。,梅毒血清学检查临床意义,梅毒感染的较早期，机体尚未产生抗体，非特异性血清学试验和特异性血清学试验均可阴性，需追踪观察。,试验结果 RPR+,TPPA- RPR+,TPPA+ RPR-, TPPA+ RPR-, TPPA-,RPR假阳性,现症梅毒，治愈的晚期梅毒,极早期梅毒，治愈的早期梅毒,排除梅毒感染,意义,极早期梅毒（尚无任何抗梅毒抗体产生）,常见结果分析,常见结果分析,常见结果分析,检测策略,检测策略,梅毒检测试剂评估结果,梅毒螺旋体抗体检测试剂评估结果,非梅毒螺旋体抗体检测试剂评估结果,梅毒诊断标准知识要点,梅毒诊断标准,梅毒诊断标准根据卫生部卫生行业标准梅毒诊断标准(WS2732007)。梅毒诊断分为一期、二期、三期、隐性和胎传梅毒。梅毒诊断原则应根据流行病学史、临床表现及实验室检查等进行综合分析。,梅毒诊断标准,梅毒经充分治疗后，应随访23年。第一年每3个月复查一次，以后每半年复查一次，包括临床和血清（非螺旋体抗原试验）。如在治疗后6个月内血清滴度未有4倍（即2个稀释度）下降，应视为治疗失败，或再感染，除需加倍重新治疗外，还应考虑是否需要作脑脊液检查，以观察神经系统有无梅毒感染。一期梅毒在1年以内、二期梅毒在2年以内多数病人可转阴。少数晚期梅毒血清可持续在低滴度（RPR或TRUST1：8)上（随访3年以上并排除神经梅毒及心血管梅毒）可判为血清固定。神经梅毒要随访脑脊液，每半年一次，直至脑脊液完全转为正常。,梅毒治疗后随访及治愈标准,谢谢。,

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