抗生素工艺学幻灯片(part-2)

1、抗生素工艺学,石晓华,第七章 -内酰胺类抗生素,第一节 -内酰胺类抗生素概述,一、 分类,-内酰胺类抗生素是一类在结构上具有-内酰胺环，呈抗菌活性的天然或经化学改造的化合物的总称。,结构上共同点：和内酰胺中N相邻的C原子上有一个羧基，在内酰胺环中和N原子相对的C原子上有一个功能团胺基。 -内酰胺类抗生素的典型化合物是青霉素（penicillin）和头孢菌素（cephalosporin）。,二、 命名,（1）在美国化学文摘上把青霉素看作是含氮杂双环庚烷的衍生物，头孢菌素为含氮双环4、2、0辛2烯的衍生物。 例如苄青霉素钠：3,3-二甲基-7-氧-6-(2-苯基乙酰胺基)-4-硫-1-含氮双环3、2、0-庚烷-2-羧酸钠。,（2）按侧链不同称为某青霉素。 青核 青霉烷酸 6-氨基青霉烷酸（6-APA ） 青霉素,苄青霉素（青霉素G ） Na盐、K盐,头核 头孢霉烷酸 7-氨基头孢霉烷酸（7-ACA）,头孢菌素 头孢菌素 C,三、物理性质与反应性能,1、母核上都带有一个羧基，其盐类易溶于极性溶剂如水中。当它们以游离酸形式存在时，可溶于有机溶剂中。但当结构中有其他取代基如氨基或酰基时，对此性质

2、有影响。 2、这类抗生素对紫外光大多有吸收峰。苄青霉素在264nm有吸收峰，为苄基的特性，头孢菌素C 在260nm处有一吸收峰，可以用此特性作为鉴别或检查的项目。,3、青霉素分子中有3个不对称碳原子，头孢菌素分子个有2个不对称碳原子，故有旋光有性。青霉素的绝对构型是2S：5R：6R，头孢菌素是6R：7R。 4、-内酰胺环中羰基的红外光谱有较高的伸缩振动频率（17701815cm-1），二级酰胺为15041695cm-1。 5、-内酰胺环为稠环系统，故环的应力增加，反应性能较强。在很多情况下易被亲核和亲电试剂作用而开环，失去活性。（降解反应）,第二节 青霉素理化性质,酸性：青霉素分子中的羧基具有相当强度的酸性，pK值2.76（25），可与有机或无机碱成盐而从溶媒中析出。 在医疗上应用的有钠盐、钾盐、普鲁卡因盐和二苄基乙二胺盐（长效青霉素、苄星青霉素），前两者易溶于水，吸收排泄快，作用时间短。后两者难溶于水，注射后，吸收缓慢，延长了作用时间。,一、溶解度,1、青霉素游离酸：在水中溶解度很小，易溶于醇、酸、醚、酯等有机溶剂。 2、青霉素盐易溶于水和甲醇，可溶于乙醇，在丙醇、丁醇、丙酮、乙酸乙

3、酯、吡啶等溶剂中难溶，但但若有机溶剂中含有少量水份时，青霉素盐溶解度大大上升。,二、抗菌活性,效价单位：能在50ml肉汤培养基中完全抑制金黄色葡萄球菌菌株发育所需的最小青霉素剂量。 青霉素G钠的理论效价为1667u/mg，其他青霉素盐均可按分子量中所含的有效青霉素组分的比例进行折算。,三、稳定性,1、稳定：固体青霉素盐的稳定性与其含水量和纯度有很大关系，净干品相当稳定，且对热稳定，150 1.5hr 效价不降，因此结晶青霉素可进行干热灭菌。pH=57较稳定（以66.5为好）；在非极性溶媒中稳定（如在无水氯仿中，350小时，活性不降低）；在缓冲力强的缓冲溶液中稳定。 2、不稳定：过酸过碱、热等均不稳定。,四、 降解反应,（一）碱性条件下 在PH=7的碱性水溶液中、-内酰胺酶、亚硫酸盐及各种重金属离子作用下青霉噻唑酸 （弱酸溶液）脱羧失羧青霉噻唑酸,有Cu2+、Zn2+、Sn2+等离子存在时，低级醇和青霉素作用生成青霉噻唑酸相应的酯，例如与甲醇生成青霉噻唑酸甲酯。,（二）酸性条件下 1、 pH 2左右，于室温条件下会发生分子重排生成青霉酸，后者若在碱性条件下（如与氢氧化钡水溶液作用），则更

4、进一步发生分子重排生成异青霉酸：,2、 pH 4左右，分子重排生成青霉烯酸：,3、酸性水解（稀酸，100）生成青霉胺和青霉醛酸，后者失去二氧化碳生成青霉醛：,（三）加热 高真空下加热，分子重排形成青霉咪唑酸：,（四）其他 1、 裂解：青霉素酰胺酶6-氨基青霉烷酸。,2、青霉素碘量法：碱性水解生成青霉噻唑酸青霉胺酸,3、比色法：青霉素与羟胺（NH2OH）氧肟酸 铁盐紫色复合物,五、 过敏反应,青霉素及其降解产物系半抗原，并不引起过敏反应，只有当其与蛋白质或多肽等大分子载体结合成多价抗原时才有抗原性。这些抗原中目前认为最重要的是青霉噻唑蛋白会引起机体的免疫变态反应，即过敏。 故提高青霉素的稳定性，减少降解产物，是消除过敏的可能性方法之一。,第三节 青霉素的发酵工艺及过程,一、 菌种 常用菌种为产黄青霉。 当前生产能力可达4000080000 u/ml。 按其在深层培养中菌丝的形态，可分为球状菌和丝状菌。,二、 发酵工艺,三、 培养基,1、碳源 2、氮源 3、前体 4、无机盐,目前普遍采用淀粉经酶水解的葡萄糖 糖化液进行流加。,可选用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸子粉，并补加无机氮源。,

5、为生物合成含有苄基的青霉素G，需在发酵中加入前体苯乙酸或苯乙酰胺。采用多次加入方式。,硫、磷、钙、镁、钾等盐类。,四、 发酵培养控制,（一）菌体生长代谢期： 1、 菌丝生长繁殖期：孢子发芽，分枝旺盛，菌浓增加快。 2、青霉素分泌期：菌落生长趋于减弱，补料加以调控，加入前体，保证产单位。 3、菌丝自溶期：菌落衰老（应在此之前做好放罐，保证提炼不乳化）。,（二）条件控制： 1、加糖控制：一般在残糖将至0.6左右，pH上升时开始加糖。 2、补氮及加前体：少量多次，或连续滴加。加硫酸铵、氨水或尿素，使发酵液氮源控制在0.010.05。补前体以使发酵液中残余苯乙酰胺浓度为0.050.08。 3、pH控制：主要通过加葡萄糖控制pH，一般为6.46.6。,4、温度控制：分期变温培养，一般前期2526，后期23，可延缓菌丝衰老，延长发酵周期，有利于发酵后期的单位增长。 5、通气和搅拌：抗生素深层培养需要通气与搅拌。空气流量为1：（0.81）v/（vmin）。 6、泡沫和消泡：可用天然油脂如豆油、玉米油或用化学合成消泡剂“泡敌”（环氧丙烯环氧乙烯聚醚类）来消泡。应当控制其用量并少量多次加入。,五、染菌及

6、异常情况处理,1、发酵罐前期染菌或种子带菌，可采用重新消毒并补入适量的糖、氮成分。 2、中后期发生染菌则应及时放罐过滤、提炼，事后彻底消毒处理。 3、发酵前期菌丝生长不良，发酵异常时可采取倒出部分发酵液，补入部分新鲜料液和良好的种子。 4、发酵单位停滞不长可酌情提前放罐。,六、提炼工艺过程,第四节 半合成青霉素,一、青霉素的化学改造部位,1、 -内酰胺环开环或者扩环均会使得到的化合物失去抗菌活性。 2、立体化学结构不能改变：C5、C6上的顺式构型； C6上氨基的-构型；C3上羧基的-构型。 3、化学改造：C6位上侧链酰基及C3位上羧基。 4、除了过敏反应未得到克服外，抗菌谱窄、不耐酸、不耐酶的缺点基本上得到克服。,二、6-氨基青霉烷酸（6-APA）,1、性质：白色片状六面体结晶，熔点208209（分解）。比旋度D30+273（c=1.2%，0.1mol/L HCl）pK值为2.3（羧基）和5.1（氨基）。等电点在水溶液中为4.3，醇溶液中为6.2。微溶于水，难溶于有机溶剂。对酸较稳定，易被强碱分解，使-内酰胺环开裂，也能被青霉素酶所破坏。6-APA本身抗菌活性很低，只能用作生产半合成青

7、霉素的原料。,2、6-APA的工业生产方法 （1）酶法裂解,酶法裂解特点：,目前多采用大肠杆菌产生的青霉素酰基转移酶（体内酶）。可直接把菌体细胞做成酶粒，或者制成固定化酶，进一步做成酶反应器。 酶法裂解工艺简单、无环境污染、经济效益明显、产品纯度较高，为6-APA的主要生产方法。,（2）化学裂解,化学裂解特点：,用硅酯法的化学裂解，6-APA收率一般可达到80以上，一度在我国化学制药领域中使用。但由于反应条件要求严格（深度冷冻）、化学原料价格昂贵、生产成本高以及环境污染等问题，已逐渐为酶法所取代。,三、半合成青霉素的分类,1、耐酸青霉素 原理：青霉素遇酸分解为无活性的青霉烯酸及青霉酸，这可能涉及侧链酰胺基的电子转移。故侧链有吸电子基团存在，防止电子转移，势必增加化合物对酸的稳定性。 苯氧乙基青霉素（非萘西林）、苯氧丙基青霉素（普匹西林）及叠氮青霉素（叠氮西林）：主要作用于革兰阳性菌，抗菌活性不及青霉素G或V，临床应用不广泛。,2、耐酶青霉素,原理：细菌对青霉素产生耐药性的主要原因是产生-内酰胺酶将内酰胺环水解为青霉噻唑酸，其水解过程青霉素必须与酶活性中心相结合，因此侧链增大（取代苯、萘

8、、异噁唑等）产生主体效应，阻碍了酶与底物结合，青霉素则不被水解，保持其抗菌活力。 甲氧西林、萘夫西林、苯唑西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林,3、广谱青霉素,原理：青霉素N与青霉素G有相同的母核，青霉素N抗革兰氏阳性菌比青霉素G弱，但抗革兰氏阴性菌比青霉素G强很多倍。因而推测侧链氨基存在对革兰氏阴性菌的作用具有重要意义。 氨苄青霉素（氨苄西林）、羟氨苄青霉素（阿莫西林）、环烯氨苄青霉素（依比西林）、氨环己青霉素（环西林）,4、抗假单孢菌青霉素,原理：侧链酰胺基位置上含有一个较氨基更强的极性基团，如羧基、磺酸基等。对大多数革兰阴性菌有良好的作用外，并对各种变形杆菌及假单孢菌也有较好的抑制作用。,四、半合成青霉素的合成方法,由6-APA酰化合成：化学酰化法、酶学酰化法 化学酰化法：由相应侧链羧酸的酰氯或混合酸酐，在无机或有机碱催化下和6-APA缩合而成，然后再经溶剂萃取及结晶制得。,第五节 头孢菌素,一、 头孢菌素C的理化性质,1、头孢菌素C为两性化合物，有两个羧基，一个氨基。 2、pK值：侧链羧基2.6；4位羧基3.1；侧链氨基9.8。 3、Na盐：呈白色或淡黄色结晶状粉末，易溶于水，不

9、溶于有机溶媒。 4、对稀酸（pH=2.58.0）及重金属离子较稳定；pH11时迅速失活。在260nm处有紫外吸收。,5、反应性,（1）酸性、中性条件下,（2）弱碱条件下,二、 头孢菌素C的发酵与精制,1、 发酵（菌种：顶头孢霉菌） 砂土管母斜面1母斜面2大米孢子种子罐发酵罐放罐提炼 发酵同样可分为三个代谢阶段： （1）生长繁殖期； （2）头C积累期； （3）菌丝自溶期。,2、 头孢菌素C的提取,头孢菌素C为氨基酸类化合物，通常以两性离子存在于水溶液中，且发酵液中伴有青霉素N、 DCPC、DOCPC、氨基酸与色素等杂质。因此从发酵液中提取头C较复杂而困难。 吸附法、溶媒提取法、离子交换法及沉淀法都可用来分离头C，但上述任何一种单一的传统方法。均达不到满意的效果。目前工业上主要采用多种分离纯化方法相结合的生产工艺。,1、预处理：发酵液冷却至15以下，硫酸酸化至pH 2.53.0，放置34h。板框过滤，水顶洗滤渣。 2、粗提：pH为2.53.0，非离子型大孔树脂XAD-4吸附。吸附完毕，去离子水洗涤（除去SO42-等阴离子。20丙酮水溶液解吸。 3、纯化：弱碱性阴离子交换树脂IRA-68 ，去离子水洗涤，1.52.5醋酸钠（钾）水溶液解吸。 4、结晶：加入醋酸锌搅拌使溶解，再加入结晶液体积30的乙醇或丙酮，即逐渐析出头C锌盐微晶沉淀。,三、头孢菌素的化学改造,1、稳定性： （1）3位双键与5位N原子的未共享电子对的共轭； （2）46元稠环系统中的-内酰胺环的张力较45元稠环系统小。,2、改造部位： （1）改变7位酰基侧链，主要影响其抗菌谱与抗菌力（7-位的取代物位于-内酰胺环的下面，阻碍了酶的攻击，减缓内酰胺环的水解，从而增强了抗耐药菌的作用）。 （2）改变3位取代基，不仅可以提高其药理代谢的稳定性（减少去乙酰产物和内酯化产物的生成），并使其抗菌活力及抗菌谱的扩大更臻完善（吸电子的取代基使-内酰胺环羰基电子云密度减少，从而增加了药物与酶的酰化反应能力，增大了抗G-菌强度）。,3、

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