微生物限度检查及效价检查技术课件

1、微生物限度检查技术 效价检查技术,成都锦华药业质量部,微生物限度检查技术,目 录,一、总则 环境、要求 二、微生物限度检查概述及限度标准 三、微生物限度检查 计数方法 四、 计数培养基适用性检查、供试品计数方法适用性试验 五、 供试品检查：检验量、供试品检查 六、控制菌检查法,一、总则,环境：微生物计数试验在不低于GMP 现行版要 求的D 级洁净环境、局部洁净度不低于B 级的单 向流空气区域内进行。 要求：全过程必须严格遵守无菌操作，防止再 污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物 的检出。 单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。, 如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容,二、微生物限度检查概述及限度标准,1、微生物限度检查的范围 （1）根据药品使用要求，把药品划为两大类：规定灭菌药品如注射剂、严重烧伤、眼科用药非规定灭菌药物：包括一般的口服固体制剂药物，这类药物允许一定限量的微生物存在，但同时规定不得有致病菌存在

2、。 （2）染菌量检查：需氧菌、霉菌酵母菌对药品的污染程度。 （3）控制菌检查： 大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌（膏剂）,二、微生物限度检查概述及限度标准,2、微生物限度检查的意义 药品染菌对使用者的潜在危害 药品中所含致病菌，这是造成药源性感染疾病的直接原因。 药品染菌还可使其产生霉变、酸败等理化性质改变造成药品失效、变质，甚至产生毒素，危害使用者的健康。 为保证药品质量，必须对微生物污染进行必要的控制和检验。,二、微生物限度检查概述及限度标准,药品染菌反映药品生产工艺的科学性、合理性及质量管理水平。 微生物限度检查的各项数据，是对药品生产工艺、生产环境、质量管理及人员素质的综合评价依据之一。 只有优良的GMP企业，才能提供优质的医药产品，凡工艺条件、生产管理水平、生产人员素质差，不注意文明生产的单位和企业，其生产的药品染菌必然严重，不合格率高。,二、微生物限度检查概述及限度标准, 药品微生物限度检查的特殊性 活体细胞 分布不匀 多数处于受损状态 生境复杂,二、微生物限度检查概述及限度标准,3、我国药典，根据药品使用的要求，将微生物限度标准分为两大类： 对于规定灭菌的

3、药品，包括注射剂和输液剂，以及用于体腔、严重烧伤、溃疡、出血及眼科用药等制剂。必须严格无菌，即在规定检验量的供检样品中不得检出活微生物。 对于非规定灭菌药品，包括常用的口服制剂与局部外用制剂。允许在规定量的样品中，检出一定限量的微生物，但不得检出某些控制菌。,二、微生物限度检查概述及限度标准,与药品质量密切相关的还有辅料、包装材料以及生产环境的检测和医用材料、器械等也都制定了相应的微生物学限度指标。,三、染菌量检查计数方法,供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，所选的方法必须具备检测充足样品量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。,三、染菌量检查计数方法,平皿法、 薄膜过滤法、 最可能数法（MPN法） MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。 供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法所选方法的适用性须经确认。,四、计数培养基适用性检查、供试品计数方法适用性试验,供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适 用性检查。

4、供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时， 计数方法应重新进行适用性试验。,四、计数培养基适用性检查、供试品计数方法适用性试验,1、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验 菌液制备及使用 菌种 试验用菌株的传代次数不得超过5 代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。,四、计数培养基适用性检查、供试品计数方法适用性试验,四、计数培养基适用性检查、供试品计数方法适用性,计数培养基适用性检查,17,四、计数培养基适用性检查、供试品计数方法适用性,计数培养基适用性检查 每一试验菌株平行制备2 管或2 个平皿；接种量不大于100cfu 同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试 结果判定： 被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.52 范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。,四、计数培养基适用性检查、供试品计数方法适用性,2、计数方法适用性试验 供试液制备 接种和稀释 抗菌活性

5、的去除与灭活 供试品中微生物的回收 平皿法 薄膜过滤法 最可能数法（MPN 法）,五、 供试品检查：检验量、供试品检查,检验量 检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml 或cm ）。 除另有规定外,一般供试品的检验量为10g 或10ml；膜剂为100cm ；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。检验时,应从2 个以上最小包装单位中抽取供试品,大蜜丸还不得少于4 丸,膜剂还不得少于4 片。 一般应随机抽取供试品，取规定容器数，混合，取规定量供试品进行检验。,五、 供试品检查：检验量、供试品检查,供试品检查 按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。 胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数； 沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母菌总数。 阴性对照试验 ：以稀释剂代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。,五、 供试品检查：检验量、供试品检查,供试液制备 根据供试品的理化特性与生物学特性,采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时,应均匀加热,且温度不应超过 45。供试液从制

6、备至加入检验用培养基,不得超过 1小时。 制备方法：匀浆仪法 利用匀浆仪高速旋转可将固体供试品快速研细，将油性基质的软膏或易吸水的胶囊剂制备成均匀的供试液。该法快捷、高效、均质、效果好，不易造成污染，为药典优选的方法。,五、 供试品检查：检验量、供试品检查,研磨法：利用研钵将固体供试品研细，将油性基质的软膏剂制备成均匀的供试液。本法劳动强度大，费时，开放式研磨，暴露时间长易造成污染 振荡法：将供试品及稀释剂置入灭菌锥形瓶内，置于振荡器上震荡，使固体供试品分散、均质。本法简便，但对水丸剂等坚硬的供试品效果欠佳，分散期长。,五、 供试品检查：检验量、供试品检查,供试液制备 常用的供试液制备方法如下，如果下列供试液制备方法经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。 水溶性供试品 取供试品，用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成 1:10 供试液。若需要，调节供试液 pH 值至 68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步 10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。,五、 供试品检查：检验量、供试品检查, 水不溶

7、性非油脂类供试品 取供试品， 用 pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或 pH7.2 磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成 1:10 供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如 0.1%的聚山梨酯 80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液 pH值至 68。必要时，用同一稀释液将供试液进一步 10倍系列稀释。,五、 供试品检查：检验量、供试品检查, 油脂类供试品 取供试品，加入无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯 80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀。表面活性剂的温度一般不超过 40（特殊情况下，最多不超过 45），小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加入预热的稀释液使成 110供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。必要时，用稀释液或含上述表面活性剂的稀释液进一步 10倍系列稀释。,五、 供试品检查：检验量、供试品检查,供试品检查 平皿法 包括倾注法和涂布法。 每稀释级每种培养基至少制备2个平皿。胰酪大豆胨琼脂培养基平板在3035培养3天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在2025培养5 天， 观察菌落生长情况,点计平板上生长的

8、所有菌落数。菌落蔓延生长成片的平皿不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。,五、 供试品检查：检验量、供试品检查,菌数报告规则 需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于 300cfu 的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于100cfu 的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。取最高的平均菌落数，计算1g、1ml 或10 cm 供试品中所含的微生物数。,五、 供试品检查：检验量、供试品检查,菌数报告规则 如各稀释级的平皿均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1 时，以1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。,五、 供试品检查：检验量、供试品检查,供试品检查 薄膜过滤法 取相当于1g、1ml 或10 cm 供试品的供试液，若供试品所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液，照方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养。 培养和计数 培养条件和计数方法同平皿计数法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。,五、 供试品检查：检验量、

9、供试品检查,菌数报告规则 以相当于 1g、1ml 或10cm2 供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以1 报告菌数 （每张滤膜过滤1g、1ml 或10cm2 供试品）,或1 乘以最低稀释倍数的值报告菌数。,五、 供试品检查：检验量、供试品检查,MPN 法 （三步五管法） 0.1 0.01 0.001 每组5管,五、 供试品检查：检验量、供试品检查,结果判断 各品种项下规定的微生物限度标准解释如下： 101cfu： 可接受的最大菌数为20； 102cfu： 可接受的最大菌数为200 103cfu： 可接受的最大菌数为2000：依此类推。 若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。,六、控制菌检查法,控制菌检查用培养基的适用性检查 控制菌检查用培养基的适用性检查，检查项目包括 促生长能力 抑制能力 指示能力,六、控制菌检查法,控制菌检查用培养基的促生长能力、抑制能力及指示特性,六、控制菌检查法,液体培养基促生长能力检查 分别接种不大于100cfu 的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。,六、控制菌检查法,培养基抑制能力检查 接种不少于100cfu 的试验菌于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及不短于规定的最长培养时间下培养，试验菌应不得生长。,六、控制菌检查法,培养基指示特性检查 用涂布法分别接种不大于100cfu 的试验菌于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及不长于规定的最短培养时间下培养，被检培养基上试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。,六、控制菌检查法,1、控制菌检查方法适用性试验 试验菌 根据各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应试验菌株，确认耐胆盐革兰阴性菌检查方法时,采用大肠埃希菌和铜绿假单胞菌为试验菌。,六、控制菌检查法,结果判断 上述试验若检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查方法进行供试品检查；若未检出试验菌，应消除供试品的抑菌活性，并重新

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