微生物优良菌种的选育ppt课件
31页1、第四章 微生物优良菌种的选育,微生物发酵的一般流程,提纲,微生物优良生产菌种的特征 自然突变选育 诱变选育 原理 基本方法 杂交育种 细菌 放线菌 霉菌 酵母菌 原生质体融合 基因工程技术 基因表达系统 利用大肠杆菌的基因表达系统 利用酵母菌的基因表达系统 基因工程菌的稳定性,优良菌种应具备的特征,对菌种的要求 天然菌种的生产性能较低,一般需要进行选育。 1.生产力:能在廉价的培养基上迅速生长,所需的代谢产 物的产量高,其它代谢产物少 2.操作性:培养条件简单,发酵易控制,产品易分离 3.稳定性:抗噬菌体能力强,菌种纯,不易变异退化 4.安全性:是非病源菌,不产有害生物活性物质或毒素,优良菌种应具备的特征,选择生产菌种应注意的因素 1.原料方面:广,转化率高; 2.产物方面:目的产物含量高,副产物少; 3.菌体方面:生长快、繁殖力强,耐受力强,抗污染、抗噬菌体能力强,遗传特性稳定 4. 设备方面:产泡沫少,适宜大罐生产。 (培养条件异,周期短,需氧量小,抗污染能力强),一、自然选育,利用微生物自然突变进行的菌种选育。 原因:多因素低剂量的诱变效应; 互变异构效应 结果:负变大于正变,应
2、经常分离纯化 方法:菌悬液平板分离上摇瓶检测 选种保藏 优点:简单易行,可与生产同步进行。 缺点:频率低,10-810-9 /次分裂。,二、诱变选育,诱导微生物发生突变进行的菌种选育,包括诱变和筛选两个步骤。 原理:染色体畸变;基因突变。 影响诱变的因素: 出发菌株(有一定生产能力,形态、生理强壮) ; 诱变剂的种类(单一或复合)与剂量(不宜过高和过 低,致死率:70-80)。 诱变剂:能提高基因突变频率的物理、化学、生物因子。 筛选比诱变更重要。 筛选的方法:通过选择/鉴别培养基加以识别。 初筛复筛确定最佳发酵条件(负变多,正变少),、营养缺陷型突变株筛选,酶缺陷,结果造成中间产物积累; 解除协同反馈,使另一分支末端产物积累; 渗漏型突变(酶未完全丧失活性,下降),末端产物少,中间产物积累。,、抗反馈阻遏和抗反馈抑制 突变株筛选,调节基因或操纵基因突变,产生的阻遏蛋白与终产物不能结合或结合; 结合,但不发生作用; 结构基因突变,使结构酶无结合能力但有催化活性; 方法:末端产物结构类似物筛选;(未突变者 死,突变为抗者,生并产菌落) 营养缺陷型回复突变株筛选。 (活性复,结构改变),、
3、组成型突变株筛选,诱导型依赖诱导物。组成型不依赖诱导物。 突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。 筛选方法:设计条件使组成型优势生长,或通过菌落分辨。 加诱导酶合成抑制物 交替培养法 显色反应法,筛选方法,加诱导酶合成抑制物 如:加邻硝基-D-岩藻糖苷,抑制-半乳糖苷酶合成。 诱导型不能利用乳糖,不长;组成型产酶,能利用乳糖,生长,被富集。 交替培养法 含诱导物(乳糖)中培养组成型快不含诱导 物(葡萄糖)中培养诱导型失酶反复。 显色反应法 不含诱导物平板培养加底物分解(有颜色变 化)检出。,.抗(敏感)性突变株筛选,包括:抗生素、金属离子、温度、噬菌体 抗生素抗性突变:提高产量; 抗噬菌体突变:消除噬菌体污染; (与噬菌体存在与否无关) 条件抗性突变:如温度,可提高产量; (温度敏感突变,高温呈营养缺陷表型) 物敏突变: 如:氟乙酸抑制顺乌头酸酶,氟乙酸敏感突变型, 顺乌头酸酶活性极低,更敏感,异柠檬酸产量 少,柠檬酸积累。,三、杂交育种,长期诱变会使菌种生活能力下降。 借助有性重组,使不同菌株的遗传物质 得以交换(获优良性状集中的重组体)。 1.细菌的杂
4、交育种 方法:转化、转导、F因子转导、R因子转移、接 合。获部分合子。 出发菌株需带遗传标记:营养缺陷、抗生素抗性、 温敏、发酵性能,、放线菌的杂交育种,基因重组过程近似细菌,育种方法与霉菌相似 放线菌的遗传体系和杂交原理: 异核现象:同一细胞(菌丝)含不同基因型的核。无 重组体出现。 接合现象:发生部分染色体转移(交换),形成部分 合子。整+部分、部分+部分。 异核系的形成:部分合子产生的无性繁殖系。能在基 本或选择培养基上生长。 (单交换,二体区) 重组体的形成:异核系不稳定,可经过双交换形成重 组子,产生重组子孢子。,放线菌的杂交方法,混合培养法:两互补缺陷型亲株混合培养,制孢 子悬液,选择性平板分离。 平板杂交法:一亲株培养,形成孢子,影印至已 分别铺有另几种孢子的平板上,获 孢子后再影印至选择平板上。 玻璃纸转移法:两亲本需要双标记,混合带纸培 养,未长气生菌丝时,纸移至一选 择平板,获异核系。解剖镜下,小 针收集小菌丝,于完全平板涂布, 获分离子。,、霉菌的杂交育种,准性生殖过程:不通过有性生殖的基因重组过程 异核体的形成:两不同性状细胞(菌丝)连接,导致一 细胞存在两个不
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