教学幻灯片：课题2.3土壤中尿素细菌的分离---分解纤维素的微生物的分离

1、尿素分子的立体结构,（一）筛选菌株,水生耐热细菌Taq ( Thermus aquaticus ) 耐高温的Taq DNA聚合酶 美国微生物学科布鲁克（T.Brock) 1966年发现耐热细菌,选择培养基 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,（二）统计菌落数目,统计菌落数目的理论依据： 当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30300的平板进行计数。,说明设置重复组的重要性。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实例启示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一

2、致，意味着操作有误，需要重新实验。,（二）设置对照,一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一种方案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,一土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。,二样品的稀释,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。,三微生物的培养与观

3、察,一无菌操作 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 二做好标记 注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。 三规划时间,1、结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。 2、是否获得了某一稀释度下，菌落数目在30300的平板。在这稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数相近？ 3、你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？,（一）空气中微生物总数的检测 （二）水中细菌总数的检测 （三）牛奶中细菌的分离与计数 （四）土壤中真菌（或放线菌）的分离与计数,专题2 :微生物的培养与应用,课题目标,1、简述纤维素酶的种类和作用； 2、从土壤中分离出分解纤维素的微生物； 3、讨论这类微生物的应用价值；,研究对象：分解纤维素的微生物,课题重点、难点 重点：从土壤中分离出分解纤维素的微生物； 难点：从土壤中分离出分解纤维素的微生物；,一、基础知识,（一）纤维素

4、与纤维素酶 （二）纤维素分解菌的筛选,（一）纤维素与纤维素酶:,1、纤维素：一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖。 棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物、木材、秸秆也富含纤维素，许多商品纤维素都是由天然纤维素制得：如水溶性的羧甲基纤维素钠（a）、不溶于水的微晶纤维素等,（一）纤维素与纤维素酶:,2、纤维素酶：一种复合酶，至少包括三种组分 C1酶（外切酶）：又称纤维二糖水解酶，作用于纤维 素的结晶区或小片段纤维素，从末端切掉 两个分子葡萄糖产生纤维二糖； Cx酶（内切酶）：作用于无定型的纤维素区域，使纤 维素断裂成片段；,葡萄糖苷酶：将纤维二糖水解成葡萄糖,纤维二糖,葡萄糖苷酶,葡萄糖（终产物）,小实验：体会纤维素酶的作用,滤纸被分解,不加,10ml,滤纸条,2号试管,滤纸未被分解,2支试管固定在50ml的锥形瓶中，140 r/min转速振荡反应 1h（如无摇床可以采用定时人工振荡的方法）,1ml,11ml,滤纸条,1号试管,观察记录结果,纤维素酶：（70-80U）,醋酸醋酸钠缓冲液：0.1mol/l,滤纸条：1cm6cm,试管编号,小实验：体会纤维素酶的作

5、用,1U表示1个酶活力单位，是指在25，其他反应条件均最适宜情况下（如PH等），1min内转化1mmol底物所需的酶的量。,刚果红染色法;: 刚果红（Congo Red,简称CR)染料可以与像纤维素这样的多糖形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。在含纤维素的培养基中加入刚果红时便形成了红色复合物。当纤维素被纤维素分解酶分解后，刚果红 纤维素复合物就无法形成，培养基上会出现以纤维素分解菌为中心的透明圆圈，通过透明圆圈来筛选纤维素分解菌。,（二）纤维素分解菌的筛选,（二）纤维素分解菌的筛选,二、实验设计,土壤取样,选择培养,梯度稀释,取样涂布：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上,挑选产生透明圈的菌落,1、培养基类型：选择培养基 2、培养基特点：纤维素作为碳源。 3、培养基配方：,制备培养基：选择培养基,上述物质溶解后加蒸馏水定容至1000ml,4、培养基的制备： （1）计算、称量：按比例和用量准确称取纤维素粉、NaNO3、Na2HPO47H2O、 KH2PO4、 KCl、 MgSO47H2O、酵母膏、水解酪素备用； （2）溶化：蒸馏水中加入上述药品后搅拌使溶解，

6、完全溶解后补加蒸馏水至1000ml；调pH。 （3）灭菌：将50ml培养基用玻棒转移至三角瓶中，塞上棉塞，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121，灭菌1530min。将培养皿用旧报纸包裹（5-8套为一包），放入干热灭菌箱内，在160170 下灭菌2h。（液体培养基不用倒平板）,制备培养基：选择培养基,1、培养基类型：鉴别培养基 2、培养基特点：加入刚果红。 3、培养基配方：,制备培养基：鉴别培养基,上述物质溶解后加蒸馏水定容至1000ml,4、培养基的制备： （1）计算、称量：按比例和用量准确称取酵母膏、 CMCNa、KH2PO4 、琼脂、土豆汁 备用； （2）溶化：蒸馏水中加入酵母膏、 CMCNa、KH2PO4 、土豆汁后搅拌使溶解充分加入15g琼脂加热熔化，并不断搅拌防，琼脂完全融化后补加蒸馏水至1000ml；调pH,制备培养基：鉴别培养基,（3）灭菌：将适量培养基用玻棒转移至三角瓶中，塞上棉塞，高压蒸气灭菌，在压力100kPa、温度为121，灭菌1530min。将培养皿干热灭菌，在160170 下灭菌2h。 （4）加入刚果红(CR):配制10mg/ml的CR溶液

7、，灭菌后，按照每200 ml培养基加1 ml的比例加入CR溶液，混匀。 （4）倒平板：待培养基冷却到50 左右时在酒精灯火焰附近倒平板。（倒平板操作同上节）,制备培养基：鉴别培养基,（一）土壤取样：资料一,1、取样环境： 富含纤维素的环境中，如多年落叶形成的腐殖土、多年积累的枯枝败叶等环境，滤纸埋入图土壤（深10cm左右）30 d左右，从已腐烂的滤纸上筛选。,2、原因： 由于生物与环境的相互依存，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。 滤纸埋入土壤是人工设置纤维素分解菌的事宜环境，使纤维素分解菌相对密集含量提高；埋入深度约为10cm左右。,旁栏思考:如果找不到合适的环境，可将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应埋进土壤中多深？,将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。,旁栏思考:为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌,由于生物与环境的相互依存，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获

8、得目的微生物的几率要高于普通环境。,（二）选择培养：资料二,资料二：在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上之前，通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需微生物。请分析旁栏培养基配方，回答问题：,（二）选择培养：资料二,1.选择培养的目的：,增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。,2.选择培养基：,（1）特点：以纤维素作为主要碳源（唯一碳源） （2）作用：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。 适合于纤维素分解菌的生存并选择增殖提高浓度； 抑制其他微生物的增殖使其浓度降低或不能增殖,参照选择培养基的比例配置，回答下列问题,（1）旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？,是液体培养基；原因是配方中无凝固剂，液体培养基有利于微生物与营养物质充分接触，有利于培养增殖（此处目的不是为了形成菌落，而是侧重于培养增殖浓度提高）,2.选择培养基：,（3）你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？,用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照 预期结果： 牛肉膏蛋白胨培养基：多种微生物可以增殖， 纤维素分解菌的浓度不会提高；

9、选择培养基：其他微生物浓度降低，纤维素分 解菌浓度提高，得到较好的实验效果,（2）这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具有，是如何进行选择的？,有；碳源是纤维素，能分解纤维素的微生物可以大量繁殖,3.选择培养的操作方法：,在腐殖土、枯枝败叶、腐烂滤纸取土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上（如无摇床，可用定时人工摇晃锥形瓶的办法），在一定温度下振荡培养12天，直至培养液变浑浊（分解纤维素的微生物比例增大） 。吸取一定的培养液（如5ml），转移到另外一瓶新鲜的选择培养液中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。可重复选择培养增加纤维素分解菌浓度使之更高；如样品中纤维素分解菌浓度较高，选择培养可不进行。,旁栏思考：为何选择培养能够“浓缩”所需的微生物？,1、可使能适应选择培养基的微生物得到迅速繁殖；2、不适应选择培养基的微生物的繁殖被抑制； 因此可以起到“浓缩”的作用,旁栏思考：本实验流程与课题2中实验流程有何异同？,差异 课题2：菌液直接涂布在以尿素为唯一氮源的固体 选择培养基上，直接分离获得菌落； 本课题： 通过液体选择培养基，使纤维素分解菌 得到增殖浓度提高后，再将菌液涂布在纤维素 鉴别（刚果红）培养基上获得菌落。 相同：其他步骤两者基本相同,按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数到106,（三）梯度稀释：,将稀释度为104106的菌悬液各取0.1ml涂布在CR鉴别培养基上，30倒置培养,（四）取样涂布：,刚果红染色法：含CR的鉴别培养基,1、筛选原理：,2、资料二：刚果红染色方法 （1）方法一：（先培养微生物再加入刚果红进行颜色反应）：在长出菌落的培养基上覆盖质量浓度为1mg/ml 的CR溶液，10-15min后倒去CR溶液，加入质量浓度为1mol/l的NaCl溶液，15min后倒掉NaCl溶液，此时产生纤维素酶的菌落周围将出现透明圈； （2）方法二：（在倒平板时就加入刚果红） ：配制10mg/ml的CR溶液，灭菌后，按照每200 ml培养基加1 ml的比例加入CR溶液，混匀后倒平板，等长出菌落后，产生纤维素酶的菌落周围将出现明显的透明圈。,方法一 缺点是操作繁琐，加入刚

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