微生物遗传课件

1、微生物的遗传变异和育种,第 七 章,遗传的物质基础 基因突变和诱变育种 基因重组和杂交育种 基因工程 菌种的衰退复壮和保藏,一、三个经典实验,转化实验,噬菌体感染实验,植物病毒的重建实验,第一节 遗传变异的物质基础,证明核酸是微生物遗传物质,1、转化实验,有 荚 膜、菌 落 光 滑 分 泌 毒 素、致 病,无 荚 膜、菌 落 粗 糙 无 毒、不 致 病,S S S 三 个 血 清 型,R R R 三 个 血 清 型,1928年，英 F.Griffith 首先发现转化现象。 实验材料： 肺炎链球菌,方法,动物实验,细菌培养实验,S型菌无细胞抽提液试验,转化实验（1）,：动物实验,杀死,无菌落生长,活菌,菌落,菌落（多） 菌落（少）,杀死,活菌,转化实验（2）,：细菌培养实验,活R菌,S菌无细胞抽提液,+,转化实验（3）,：S型菌无细胞抽提液试验,大量R菌落和少量S菌落,1944年，O . T . Avery等人将S菌的糖类、脂类、蛋白质、核酸等提纯后分别与R活菌混合进行转化实验，结果：,结论：转化因子是DNA， DNA 是细菌遗传信息的载体。,步骤,2、噬菌体感染实验,1952年，A.

2、D . Hershey和M. Chase，同位素标记。,结论：噬菌体侵入细菌细胞内的仅仅是DNA,蛋白质外壳留在细胞外；而子代噬菌体既有噬菌体DNA,又有噬菌体蛋白质外壳，证明DNA是噬菌体遗传信息的载体。,用35S-蛋白质标记的噬菌体感染细菌： 放射性（蛋白质外壳）主要在无细胞上清液中。 用32P-DNA标记的噬菌体感染细菌： 放射性(噬菌体DNA)主要在沉淀物中(细菌细胞内)。,结果,步骤：,3、植物病毒的重建实验,1956年，H. Fraenkel - Conrat利用含RNA的TMV进行植物病毒的重建实验。,方法,结论：证明RNA是RNA病毒遗传信息的载体。,遗传物质存在部位,核染色体,核外染色体,真核生物细胞器,原核生物质粒,二、遗传物质在微生物细胞内的存在部位和方式,（一）遗传物质在细胞内存在的七个水平：自学,1、细胞水平 2、细胞核水平 3、染色体水平 4、核酸水平 5、基因水平 6、密码字水平 7、核苷酸水平,P192197,（二）原核生物的质粒（典型的质粒）,1、质粒：P197,2、特点：P197198,1）质粒是核基因组外的小型cccDNA，少数成线状。,2）质粒携

3、带某些特殊功能基因，但对细胞的生存并非必需。,3）质粒具有独立复制能力。,严紧型复制控制：P197 松弛型复制控制：P197,4）某些理化因子能引起质粒消除。,5）F因子、R因子等某些质粒能在不同菌株间发生转移。,6） F因子等某些质粒是附加体。 附加体：P197 整合：P197,7）某些质粒具有基因重组功能。,3、质粒在基因工程中的应用,作为目的基因的克隆载体。如：E.coli的pBR322质粒。,4、典型质粒简介,F质粒（F因子）：存在于E.coli等多种细菌。决定性别，与细菌接合有关。,R质粒（R因子，抗药性质粒）：存在于志贺氏菌等多种肠道菌中，与抗药性（磺胺、抗生素等）有关。,Col质粒（大肠杆菌素质粒）：存在于E.coli的某些毒株中，产大肠杆菌素（一种细菌毒素）。,Ti质粒（诱癌质粒）：存在于根癌土壤杆菌中，诱发双子叶植物细胞发生癌变。广泛用于植物基因工程中。,降解性质粒：存在于假单胞菌属细菌，是一类降解特殊有机物（樟脑、二甲苯等）的质粒总称。如：CAM（樟脑）质粒、OCT（辛烷）质粒、XYL（二甲苯）质粒等。,：P199201, “超级菌”：通过遗传工程手段构建的具有数种

4、降解性质粒的工程菌。,一、基因突变：P202,第二节 基因突变和诱变育种,野生型：从自然界分离到的未发生突变的菌株。,原养型：突变体回复突变成野生型性状的菌株。,突变体：发生基因突变后的微生物菌株。,(突变型、突变株),(一)微生物突变体的主要类型,：P202203,1、营养缺陷型 如：E.coli Trp-。,选择性突变株,非选择性突变株,4、形态突变型,5、抗原突变型,6、产量突变型 正变株 负变株,如:色素突变株、无荚膜突变株。,选择性突变株：能在选择性培养基上加以鉴别的突变株。,3、条件致死突变型 如：E.coli Ts突变株。,2、抗性突变型 如：E.coli str R。,（三）基因突变的特点：P203204,1、自发性 2、不对应性 3、稀有性 4、独立性 5、可诱变性 6、稳定性 7、可逆性,（二）突变率,：P203。,（四）基因突变自发性和不对应性的证明,变量试验、 涂布试验、 影印培养试验,变量试验,（1943年，Luria和Delbruck）,涂布试验,（1949年，Newcombe）,影印培养试验,（1952年，Lederberg等）,（五）基因突变及其诱变机制

5、,自发突变,基因突变,诱发突变,突变都是自发的，某些理化因素不能改变突变方向，但可显著提高突变频率。,无论自发突变还是诱变，从分子水平看，都是DNA分子结构发生变化的结果，机制相同。,诱变剂：能显著提高突变频率的各种理化因素。,二、突变与育种,（一）自发突变与育种,突变是不定向的，但通过定向培育可获得特定的变异菌株。,从生产中选育：从低频率的自发突变中选育可能出现的正突变株。,定向培育优良品种：利用微生物的自发突变，采用特定的选育条件，不断移植选育出优良菌株。,（二）诱变育种,诱变育种：利用诱变手段使微生物细胞发生变异，从中筛选出符合要求的变异菌株的方法。,1945,时间,1943,1943,1943,1947,1955,1971,1977,目前,发酵单位( 效价，u / ml ),100,250,500,850,850,8000,2万,5万,510万,从 青 霉 素 产 量 看 诱 变 育 种,1、诱变育种的基本环节,选择出发菌株：诱变育种成败的关键。 诱变处理：微生物大多死亡，少数存活。 筛选：分初筛和复筛。从少数存活（其中多数未变）的少数突变株中选育出极少数性状优良的正变株。,大

6、多死亡,少数存活,存活率,多数未变,少数突变,突变率,多数负变,少数正变,正变率,多数 幅度小,少数 幅度大,高产率,投产率,多数 不宜投产,少数 适宜投产,出发菌株,计算：,诱变,（2）挑选优良的出发菌株,（1）选择简便有效的诱变剂,（3）处理单孢子（或单细胞）悬液,（4）选用最适诱变剂量,（5）利用复合处理的协同效应,（6）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标,2、诱变育种中应考虑的几个原则,（7）设计高效筛选方案,（8）创造新型的筛选方法,（1）选择简便有效的诱变剂,1）常用诱变剂：紫外线、烷化剂、5-Bu、吖啶类染料等,2）“三致”物质,“三致”物质：对生物具有致突变、致畸变、致癌变的化学物质。,艾姆斯试验法（Ames test）：P215。,利用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium，S.t.)组氨酸营养缺陷型的回复突变检测致癌剂。,A、原理：,S.t.his-,在基本培养基（M M 或 - ）上培养,不生长,S.t.his-,致癌物,生长,菌株发生回变,S.t.his+,在 - 上培养,（原养型）,B、方法,吸入滤纸片,保温,鼠肝匀浆（含加氧酶等）,

7、可 疑 “ 三 致 ” 试 样,平贴于含S.t.his-的基本培养基平板上培养,结果：,阳性,生产中用过的自发突变菌株,性状优良的菌株,已诱变过的其他变异菌株,野生型菌株,对诱变剂敏感性较高的菌株,（2）挑选优良的出发菌株,1）出发菌株：用于诱变育种的原始菌株。,2）出发菌株的选择：凭经验。,可供选择的出发菌株有：,细菌、酵母菌：使用指数期营养体单细胞悬液。 但芽孢杆菌应处理芽孢。 放线菌、霉菌：用单孢子悬液。孢子要稍加萌发后使用。,出发菌株应制成均匀分散的单细胞或单孢子悬液,（3）处理单孢子（或单细胞）悬液,处理单孢子（或单细胞）悬液的原因：,A、使用均匀分散的悬液，有利于每个细胞（孢子）均匀接触诱变剂。 B、处理单核的单细胞（孢子），有利于减少诱变后的菌株经传代后出现不纯菌落 ，导致性状“衰退”。,诱变剂量 = 诱变剂浓度（或强度）处理时间 但通常用相对剂量（杀菌率）表示：,（4）选用最适诱变剂量,诱变剂杀菌率=（1- ）100%,诱变后活细胞数 诱变前活细胞数,1）诱变剂量,2）剂量与细胞存活率、杀菌率、突变率的关系,剂量：,细胞突变率：,低,高,细胞存活率：,高,低,杀菌率(致

8、死率)：,低,高,低,低,高,3）合适剂量,合适剂量：能扩大变异幅度又能促使变异移向正变范围的剂量,紫外灯 15 W 照射距离 30 cm 处理时间 10 20 秒 至 10 20 min 杀菌率 70 75 % 或 30 70 %,UV的 合适 剂量,化学诱变剂的合适剂量：较复杂。 常用浓度为0.01 0.1mol/L；处理时间依杀菌率定。,两种或多种诱变剂先后使用,同种诱变剂先后重复使用,两种或多种诱变剂同时使用,（5）充分利用复合处理的协同效应,利用诱变剂复合处理，能提高诱变效果。,（6）利用和创造形态、生理 与产量间的相关指标,利用和创造形态、生理 与产量间的相关指标能提高初筛效率。,产淀粉酶突变菌株的筛选：淀粉水解试验。,产淀粉酶活性不同的菌株的菌落,淀粉培养基,加碘液,有无:生理指标 形态指标 大小:产量指标 形态指标,类似有：蛋白质水解圈、氨基酸显色圈、纤维素水解圈、抗生素抑菌圈等。,（7）设计高效筛选方案,1）通过初筛和复筛两个阶段来筛选优良突变株。,2）对“诱变-筛选”作多轮操作可提高诱变育种的效率。,（8）创造新型的筛选方法,1）优化诱变育种的工作步骤和操作方法。,

9、2）与遗传工程育种相结合，与自动化、电脑化的高效筛选技术相结合。,3、突变株的筛选方法,几个概念：P221,相关培养基,基本培养基（M M，-）,完全培养基（C M，+）,补充培养基（S M，A或B等）,三类遗传型,野生型 A+B+,营养缺陷型 A+B-,原养型 A+B+,（1）产量突变株的筛选,（2）抗性突变体的筛选,酵母菌吡哆醇高产突变株的筛选：梯度平板法,待凝后接种经诱变处理的菌悬液,融化的、不含药物的琼脂培养基10ml,融化的、含异烟肼的琼脂培养基10ml,待凝后放平,涂布,培养,异烟肼浓度梯度,低浓度药物区： 大量敏感菌菌苔,高浓度药物区： 几乎无菌落,适宜浓度药物区： 抗性菌落 (吡哆醇高产突变株),高 低,抗药性菌株的可能特性,A、诱变产生了抗药性基因，能编码分解药物的酶 B、诱变产生的基因使某种代谢产物过量合成，解除了抗代谢物（药物）的竞争性抑制作用。,本例中，异烟肼（药物）是吡哆醇（正常代谢物）的抗代谢物，突变菌株的抗药性即为吡哆醇过量合成。,1）诱变处理：与一般诱变处理相同。,2）淘汰野生型（浓缩营养缺陷型）,（3）营养缺陷型突变株的筛选,营养缺陷型突变株也是一种常用的选择性遗传标记菌株。,常用方法,抗生素法,菌丝过滤法：适用于放线菌和丝状真菌,青霉素法：适用于细菌,制霉菌素法：适用于真菌,淘汰野生型的基本原理和操作方法,接种到含 青霉素的MM上培养,诱变处理的细菌,野生型：在MM上生长时细胞壁合成被抑制，导致死亡,营养缺陷型：在MM上无法生长，处于休止状态，不死亡,接种到含 制霉菌素的MM上培养,诱变的酵母菌或霉菌孢

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