微生物菌种及其复壮与保藏课件

1、微生物发酵工程,2 微生物菌种及其复壮与保藏,复习,现代微生物发酵工程研究的内容,2,2 微生物菌种及其复壮与保藏,2 微生物菌种及其复壮与保藏,3,2 微生物菌种及其复壮与保藏,2.1工业生产常用的微生物及要求,1. 细菌: 分布最广,数量最多,单细胞原核, 二分裂殖. 枯草芽孢杆菌- 淀粉酶、蛋白酶 嗜热乳杆菌-乳酸 醋酸杆菌-醋酸 棒状杆菌-氨基酸 短杆菌-肌苷酸,工业生产常用的微生物,4,2 微生物菌种及其复壮与保藏,2.酵母菌: 单细胞真核, 含糖,偏酸,腐生,出芽繁殖, 假丝. 啤酒酵母-酿酒、细胞色素C、单细胞蛋 白、 甘油、琥珀酸 假丝酵母-面包、石油脱蜡、饲料 类酵母-脂肪酶,工业生产常用的微生物,5,2 微生物菌种及其复壮与保藏,3.霉菌:丝状真菌 生产菌种:根霉,毛霉,犁头霉,红曲霉,青霉等 产品:酶制剂; 抗生素;有机酸;甾体激素,工业生产常用的微生物,6,2 微生物菌种及其复壮与保藏,4.放线菌: 原核生物, 有机质丰富的,微碱性土壤中, 无形包子或菌丝片断繁殖. 生产菌种:链霉菌属;小单孢菌属; 诺卡菌属等 产品:链霉素; 红霉素; 金霉素;庆大霉素等,工业

2、生产常用的微生物,7,2 微生物菌种及其复壮与保藏,微生物工业对菌种的要求,产物 分泌 型,8,2 微生物菌种及其复壮与保藏,菌种退化：生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良的菌株，由于进行一种传代或保藏之后，群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失的现象。,2.2 菌种的退化与复壮,9,2 微生物菌种及其复壮与保藏,退化的表现,产物合成能力下降,产量下降,发酵力或糖化力降低,孢子数量变化,菌落大小变化,生长能力和生长速度变化,10,2 微生物菌种及其复壮与保藏,1.菌种退化的原因,退化原因,基因突变,质粒的脱落,培养和保藏 条件的影响,连续移代,11,2 微生物菌种及其复壮与保藏,基因突变导致菌种退化： 自发突变与回复突变 10-7-10-9,低产株,低产株,高产株,高产株,12,2 微生物菌种及其复壮与保藏,质粒脱落导致菌种退化： 控制产量的质粒脱落或核内DNA和质粒复制不一致。 连续传代加速退化的发生：,大量低 产突变株,传代,个别低产突变株,13,2 微生物菌种及其复壮与保藏,不良的培养条件如营养成分、温度湿度、pH值、通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等不仅会诱

3、发低产基因型出现，而且会造成低产基因和高产基因细胞的数量比发生变化。,14,2 微生物菌种及其复壮与保藏,延缓退化,了解退化的原因,分离纯化,科学保藏,减少传代,15,2 微生物菌种及其复壮与保藏,2.菌种退化的防止,尽量减少传代,16,2 微生物菌种及其复壮与保藏,17,2 微生物菌种及其复壮与保藏,3.菌种的复壮及其方法 复壮原理 狭义复壮：从大量退化的菌株中分离筛选到那些仍保持优良性状的个体 广义复壮：在菌种的生产性能尚未退化前就经常有意识地进行纯种分离与生产性能的测试工作,18,2 微生物菌种及其复壮与保藏,复壮方法,低温等条 件处理, 使部分退 化菌株死亡,对于寄生性 微生物的退 化菌株,可通 过接种到的 昆虫或动物 寄主体内以 提高菌株毒 性,19,2 微生物菌种及其复壮与保藏,2.3菌种的保藏 一.菌种保藏 广义：在广泛收集实验室和生产菌种、菌株的基础上，将它们妥善保管，是指达到不死、不衰、不污染以便于研究、交换和使用的目的。 狭义：防止菌种退化、保持菌种的生活能力和优良的生产性能，尽量减少、推迟负突变、防止死亡，并确保不污染杂菌。,20,2 微生物菌种及其复壮与保藏,原

4、理,干燥,低营养,低温,21,2 微生物菌种及其复壮与保藏,由于各种微生物的生理，遗传特性不同，适合采用的方法不同,。,方 法,有效性,通用性,简便性,22,2 微生物菌种及其复壮与保藏,微生物菌种的保藏法,23,2 微生物菌种及其复壮与保藏,(一).斜面保藏法 特点：简便有效，易变异，退化甚至死 亡。 适合：不要求长期保藏的及不适合冷冻干 燥的。 保存期: 3个月,24,2 微生物菌种及其复壮与保藏,影响保藏 效果因素,培养条件,25,2 微生物菌种及其复壮与保藏,（二） .液体石蜡油保藏法 保存期: 2-3年，甚至5年传代一次. 特别适合:在固体培养基上不能形成孢子的丝状担子菌，如大型食用真菌和药用真菌以及镰刀菌、红曲霉等. 注意：保藏温度，液体石蜡需灭菌和除水,26,2 微生物菌种及其复壮与保藏,（三）.干燥保藏法,适合产孢子 的霉菌和放 线菌,适合丝状 真菌和酵 母菌,27,2 微生物菌种及其复壮与保藏,砂土,沙土管,菌种,粒度，除钙，除铁及pH 。砂和土混合比例：1：1或3：2。121 间歇灭菌3次，每次1-1.5小时,埋沙土,干法,湿法,细胞浓度 108-109 /ml,

5、0.2-0.3ml/支。抽真空干燥 4小时,砂土保藏法,特点:经济简便，保存时间长，不易变异。一般2-3年.,28,2 微生物菌种及其复壮与保藏,冷冻干燥法:用保护剂制备菌悬液， 然后将含菌样快速降至冰冻状态，减压抽真空，使冰升华成水蒸汽排出，从而使含菌样脱水干燥， 并在真空状态立即密封瓶口隔绝空气，造成无氧的真空环境， 然后置于低温下保存。 特点：不易发生变异，5-10年。需要冻干机。 适用：除了一些不产孢子的丝状真菌外。,（四）. 冷冻干燥保藏法,29,2 微生物菌种及其复壮与保藏,30,2 微生物菌种及其复壮与保藏,31,2 微生物菌种及其复壮与保藏,1.安剖瓶：2% 盐酸浸泡7-10h。 装入标签，塞上棉花，灭菌备用。 2保护剂：选择适合的种类。,32,2 微生物菌种及其复壮与保藏,33,2 微生物菌种及其复壮与保藏,成长良好，健壮,无污染,稳定期,高浓度,菌种,3.菌种制备,34,2 微生物菌种及其复壮与保藏,预冻：防止泡沫溢出，冻结，升华。 不低于-20， 30min ， 疏松状态 时，转入室温抽1h， 融封， 检测真 空度，4，避光。,4.预冻和真空干燥,35,2 微生物

6、菌种及其复壮与保藏,冻干物呈酥块状或松散片状 真空度接近空载时的最高值 以等量水作对照,干燥终止：,36,2 微生物菌种及其复壮与保藏,恢复培养：室温下平衡后，加入最适培养基，控制溶化速度，操作靠近火焰。 避免：样品逸散，污染。,37,2 微生物菌种及其复壮与保藏,常温下直接真空干燥。设备简单，操作方 便。 适于: 预冻后易受冻伤的菌株,（五）真空干燥法,38,2 微生物菌种及其复壮与保藏,以甘油、二甲基亚砜等作保护剂，在液氮超低温下保藏的方法。 是防止退化的最有效的方法。 适合于各种微生物的保藏。 原理：菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来。,（六）.液氮超低温法,39,2 微生物菌种及其复壮与保藏,保护剂：甘油，二甲基亚砜，糊精，血清蛋白等。 不同微生物的保护剂不同，需实验确定。 甘油10-20%，二甲基亚砜5-10% 安剖瓶的选择：95料或GG17的玻璃管制成。,液氮超低温法,40,2 微生物菌种及其复壮与保藏,菌种制备和冻结保藏：孢子或菌丝体。-35 以前控制降温速度。 恢复培养:38-40 水中 注意防护：防冻，防爆。,41,2 微生物菌种及其复壮与保藏,菌种保藏注意事项,42,2 微生物菌种及其复壮与保藏,思考题,1.菌种退化有哪些原因?如何避免? 2.列举出3种微生物保藏法并说出其适用范围 3.作为工业生产用的菌种必须具备哪些条件,?,43,2 微生物菌种及其复壮与保藏,

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