微生物遗传_1课件

1、第8章 微生物遗传,基因的水平转移：,个体A,个体B,遗传物质,通过基因的重组可使后者（个体B）及其后代 的性状发生改变。,细菌所特有的基因重组形式，有别于一般有性过程中 的亲本和其后代之间遗传信息的垂直传递形式。,细菌基因的水平转移和重组,本节重点：三种基因水平转移方式及其应用,水平基因转移（Horizontal gene transfer, HGT） ，不仅发生在不同的微生物细胞之间，而且也发生在微生物与高等动植物之间。 生物间基因的转移和交换是普遍存在的，是生物进化的重要动力之一。,第3节 细菌基因的水平转移和重组,细菌的三种水平基因转移形式,接合（Conjugation）,转导（Transduction）,转化（Transformation）,接合 (conjugation)：,细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）,转导(transduction)：,由噬菌体介导,自然遗传转化(natural genetic transformation)：,游离DNA分子 + 感受态细胞,一、细菌的接合作用(conjugation),通过细胞与细胞的直接接触而产生的 遗传信息的转移和重组过程

2、,1.实验证据,1946年，Joshua Lederberg 和Edward L.Taturm 细菌的多重营养缺陷型杂交实验,中间平板上长出的原养型菌落 是两菌株之间发生了遗传交换 和重组所致！,证实接合过程需要细胞间的直接接触的 “U”型管实验（ Bernard Davis，1950 ）,接合： 供体与受体细胞直接接触，借性菌毛传递DNA，在受体细胞中发生交换、整合，使之获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞就称接合子。,2. 机制,(大肠杆菌的接合机制),接合作用是由一种被称为F因子的质粒介导,F因子的分子量通常为5107，上面有编码细菌产生性菌毛 （sex pili）及控制接合过程进行的20多个基因。,含有F因子的细胞：“雄性”菌株（F+），其细胞表面有性菌毛,不含F因子的细胞：“雌性”菌株（F-），细胞表面没有性菌毛,第3节 细菌基因的水平转移和重组,细菌的三种水平基因转移形式,接合,转导,转化,二、细菌的转导（transduction）,由噬菌体介导的细菌细胞间进行遗传交换的一种方式： 一个细胞的DNA通过病毒载体的感染转移到另一个细胞中,能将一

3、个细菌宿主的部分染色体或质粒DNA 带到另一个细菌的噬菌体称为转导噬菌体,细菌转导的二种类型：,普遍性转导,局限性转导,定义：以温和噬菌体为媒介，将供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，称转导子。,1、普遍性转导（generalized transduction）,噬菌体可以转导给体染色体的任何部分到受体细胞中的转导过程,(1) 意外的发现,1951年，Joshua Lederberg和Norton Zinder为了证实大肠杆菌以外 的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型 的鼠伤寒沙门氏菌进行类似的实验：,用“U”型管进行同样的实验时，在给体和受体细胞 不接触的情况下，同样出现原养型细菌！,三、细菌的遗传转化（genetic transformation）,定义：同源或异源的游离DNA分子(质粒和染色体DNA)被自然 或人工感受态细胞摄取，并得到表达的水平方向的基因转移过程,自然遗传转化（natural genetic transformation）,人工转化（artifici

4、al transformation）,感受态细胞：具有摄取外源DNA能力的细胞,（competent cell）,R型活菌+S型死菌 S型活菌 定义：受体菌自然或在人工技术作用下直接摄取来自供体菌的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。转化后的的受体菌称为转化子（transformant）。 有关名词： 受体菌：recipient/receptor，转化基因的接受者 供体菌：donor，转化基因的提供者 转化因子：来自供体菌的DNA片段 转化子：transformant，将转化基因重组进入自身染色体组的重组子,转化（transformation）,1、转化及其发现：,受体细胞要处于感受态. 感受态：competence，受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态 供体DNA片段（转化因子）大小适宜，分子量一般为1 107 D 左右 菌株间的亲缘关系密切,2、转化发生的条件：,3、转化的类型：,根据感受态建立的方式，可以分为： 自然遗传转化natural genetic transformation 人工转化arti

5、ficial transformation,感受态：,出现时间：只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态出现在不同生长时期 Streptococcus pneumoniae的感受态出现在生长曲线中的指数期的中期；Bacillus的一些种则往往出现在指数期末及稳定期的初期。 感受态由细胞的遗传性决定，但同时也受环境因子的影响：cAMP、Ca2+等最明显。如用CaCl2 处理E. coli可以诱发其产生感受态。 感受态细胞的比例：当处于感受态高峰时，群体中呈感受态的细胞因菌种而不同. Bacillus subtilis不超过1015% Streptococcus pneumonia和Haemophilus influenzae（流感嗜血杆菌）达到100% 转化DNA的最低浓度：在群体中含有15%感受态细胞时，0.1gDNA/ml细胞悬液即可有效发生转化,1、自然遗传转化（简称自然转化）,1928年，Griffith发现肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae） 的转化现象,目前已知有二十多个种的细菌具有自然转化的能力,进行自然转化，需要二方面必要的条件：,建立了感受

6、态的受体细胞,外源游离DNA分子,2、人工转化,用CaCl2处理细胞，电穿孔等是常用的人工转化手段。,在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段， 是基因工程的奠基石和基础技术。,不是由细菌自身的基因所控制；,用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一 种可以摄取外源DNA的“人工感受态”。,质粒的转化效率高；,接合 (conjugation)：,细胞与细胞的直接接触（由F因子介导）,转导(transduction)：,由噬菌体介导,自然遗传转化(natural genetic transformation)：,游离DNA分子 + 感受态细胞,诱变育种：是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。,诱变育种具有极其重要的实践意义。当前发酵工业和其他微生物生产部门所使用的高产菌株，几乎毫无例外地都是通过诱变育种而明显提高其生产性能的。,第四节 诱变育种,可见，设计和采用效率高的筛选方案和方法极其重要。,以选育高产突变株为例，诱变育种的基本环节概括如下：,诱变育种的步骤：,原始菌种,纯化,

7、斜面/肉汤培养,单孢子/单细胞悬液,诱变剂处理,平板分离,移至斜面,小试,中试,初筛,复筛,计算存活率,观察形态变异，挑单菌落,良种保藏,原菌种特性鉴定,诱变育种的基本过程：,选择选择合适的出发菌株 制备待处理的菌悬液 诱变处理 筛选 保藏和扩大试验,1.出发菌株的选择： 出发菌株用来育种处理的起始菌株 出发菌株应具备： 对诱变剂的敏感性高； 具有特定生产性状的能力或潜力； 出发菌株的来源； 自然界直接分离到的野生型菌株： 历经生产考验的菌株： 已经历多次育种处理的菌株：,3.诱变处理： 诱变剂的作用： 提高突变的频率 扩大产量变异的幅度 使产量变异朝着正突变或负突变移动 剂量的表示法：不同种类和不同生长阶段的微生物对诱变剂的敏感程度不同，所以在诱变处理前，一般应预先作诱变剂用量对菌体死亡数量的致死曲线，选择合适的处理剂量。致死率是最好的诱变剂相对剂量的表示方法。 最适剂量的选择：产量性状的育种中多倾向于低剂量（致死率在70-80%）,选择诱变剂的种类：在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最

8、方便，而在化学诱变剂中，一般可选用诱变效果最为显著的“超诱变剂”，如NTG。 简便有效的诱变方法：紫外线的照射最为方便。 化学诱变剂的种类、浓度和处理方法尤其是中止反映的方法很多，实际工作时可参看有关书籍。一种较有效的简易处理方法的大致操作步骤是：先在平板上涂上出发菌株细胞，然后在平板上均匀地放上几颗很小的诱变剂颗粒（也可放吸有诱变剂溶液的滤纸片），经培养后，在制菌圈的边缘挑取若干突变菌落，分别制成悬浮液，然后将其涂在一般平板表面使长出许多单菌落，最后可用影印培养法或逐个检出法选出突变种。,4. 菌种筛选,4.1 筛选方案： 实际工作中，为了提高筛选效率，往往将筛选工作分为初筛和复筛两步进行。 初筛的目的：删去明确不符合要求的大部分菌株，把生产性状类似的菌株尽量保留下来，使优良性状的菌株不至于漏网；因此，初筛工作以量为主，测定的精确性还在其次；初筛手段应尽可能快速、简单。 复筛的目的：确认符合要求的菌株；复筛以质为主，应精确测定每个菌株的生产指标。,筛选是最为艰难的也是最为重要的步骤.,第五节 菌种保藏,性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则 生产或科研都无法正常进行。,影

9、响微生物菌种稳定性的因素：,a）变异；使原有的优良性状发生负变，即菌种的衰退（degeneration）,b）污染；,c）死亡；,一、菌种的衰退与复壮,1）从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有 原有典型性状的菌种。,2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种 维护工作中不断筛选“正变”个体。,大量群体中的自发突变,菌种的复壮：,a）纯种分离；,b）通过寄主体进行复壮；,菌种衰退的特点：,菌种的复壮措施,纯种分离 菌落纯的分离方法（平板表面涂布法，平板划线分离法，琼脂培养基浇注法） 细胞纯的分离方法（分离小室进行单细胞分离，显微操纵器进行单细胞分离，菌丝尖端切割法进行单细胞分离） 通过宿主体内生长进行复壮（如Bacillus thuringiensis的复壮） 淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）,二、防止衰退的措施,1）减少传代次数；,2）创造良好的培养条件；,3）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；,4）采用有效的菌种保藏方法；,三、菌种保藏,在一定时间内使菌种不死、不变、不乱,基本要求：,基本方法：,生活态 休眠态,培养基传代培养,寄主传代培养,冷冻,干燥,斜面、平板,液氮、低温冰箱,沙土管、冷冻真空干燥,几种常用菌种保藏方法的比较,三、菌种保藏,由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同 的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适 宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏 物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微 生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因 某种方法的失败而导致菌种的丧失。,

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