微生物的培养与应用幻灯片

1、专题2 微生物的培养与应用,一、微生物的实验室培养,（一）培养基,人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质. 培养基的基本成分 基本营养要素：各种培养基一般都含有水、碳源、氮源、无机盐。此外还要满足不同微生物生长对pH、特殊营养物质(维生素,氨基酸)以及氧气的需求,培养基的分类,按培养基的物理性质分为 液体培养基：配制成的液体状态的基质，一般用于生产。 固体培养基：在液体培养基中加入凝固剂 (如琼脂)，配制成固体状态的基质，琼脂固体 培养基是实验室中最常用的培养基之一。 按照化学成分 天然培养基：由天然成分配置而成，成分不明确，用于工业生产 合成培养基：成分明确。,按照目的用途,（二）无菌技术,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法技术。,获得纯净培养物的关键是防止外来杂菌的入侵，无菌技术就是围绕着如何避免杂菌污染的操作技术。包括以下几个方面,对实验操作的空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒。 将用于微生物培养的器皿（培养皿）、接种用具（接种环，涂布器）和培养基等进行灭菌。 为避免周围环境中微生物的污染，实验操作应在酒精灯火焰附近进行。 实验操

2、作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。,消毒,无菌技术的种类,灭菌,使用较为温和的方法来杀死部分微生物。,使用较为强烈的理化因素杀死物体内外的所有微生物（包括芽孢和孢子）。,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min，适用于不耐高温的液体 3、化学药剂消毒法:用75%酒精、进行皮肤消毒;氯气消毒水源。 4、紫外线消毒：接种室，接种箱或超净工作台使用前用紫外线照射30分钟，在照射前，适量喷洒石碳酸，煤酚皂。,(1)消毒的方法：,1.灼烧灭菌：接种环，接种过程中的试管口或瓶口，放在酒精灯火焰的充分燃烧层中进行灼烧灭菌。,（2）常用的灭菌方法,2.干热灭菌：将玻璃器皿、金属用具等能耐高温并需要保持干燥的物品放到干热灭菌箱内，在160170OC中加热12h即可。,3.高压蒸汽灭菌:（湿热灭菌）将需灭菌的物品放到盛有水的高压灭菌锅内煮沸，待冷空气排尽后，密闭继续加热至锅内压力到100kPa，温度到121OC后，维持1530min即可。培养基，培养皿。,二、大肠杆菌的纯化培养,（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基,1.牛肉膏

3、蛋白胨固体培养基配方,2.称量 按比例称取各种物质，注意事项：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。,3.溶化：先将牛肉膏连，加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加蒸馏水定溶至100mL。,4.灭菌(先调PH)将配制好的培养基放到三角形瓶中（瓶口加棉塞，包上牛皮纸），放到高压锅内灭菌；培养皿（用几层报纸包好）放入干热灭菌箱内灭菌。,5.倒平板：待培养基冷却到50OC左右时倒平板,3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？,4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？,平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。,空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。,接种纯化,原理：在培养基上将细菌稀释分散成单个细胞，使其长成单个的菌落，这个菌落就是一个纯化的细菌菌落。 菌落：由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞

4、群体。不同微生物繁殖形成的菌落在颜色，大小，形状不同。 接种方法：平板划线法、稀释涂布平板法。,平板划线法是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分解到培养基的表面； 稀释涂布平板法：则将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。 (3)菌种的保藏 短期保存：固体斜面培养基上4保存，菌种易被污染或产生变异。 长期保存：20甘油管在冷冻箱中保藏。,操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后仍然要灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。,1、为什么在操作的第一步以及划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环？,2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？,以免

5、接种环温度太高，杀死菌种。,划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。,涂布平板操作,(1)将涂布器浸在盛有70的酒精的烧杯中。,(2)取少量菌液（不超0.1mL），滴加到培养基表面。,(3)将沾有酒精的涂布器在火焰上引燃，火熄后冷却810s。,(4)用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。,土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,（一） 筛 选 菌 株,原理 人为提供有利于目的菌株的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。 在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。 寻找目的菌：根据它对环境的要求，到相应的环境中去找,（4）细菌分离的流程与计数,细菌分离与计数的实验流程 土壤取样样品稀释配制培养基取样涂布微生物培养观察并记录菌落数细菌计数。 选取菌落数在30300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。 计算公式：每克样品

6、中的菌株数C/VM，其中C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。,三、课 题 延 伸,能分解尿素的细菌的鉴定,鉴定的原理： 细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，会使培养基的pH升高。 鉴定方法： 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，利用此培养基进行细菌培养，观察培养基的颜色变化。,分解纤维素的微生物的分离,纤维素：一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，属于多糖。广泛地存在于植物的根、茎、叶等器官中。一般动物和人不能分解。植物中棉花中纤维素含量最高,纤维素菌分离方法：刚果红染色法,刚果红能与纤维素形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。,用加入刚果红的纤维素培养基去培养微生物时，如果培养基中出现以菌落为中心的透明圈时，可说明该菌落是纤维素分解菌，因为它已将被刚 果红 染成红色的纤维素分解了。,命题热点1 关于实验考查 【例1】 有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究和作用，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。研究人员用化合物A、硝酸盐、磷酸盐以及微量元素配制的培养基，

7、成功的筛选到能产生纤维素酶的微生物。分析回答问题。 (1)培养基中加入的化合物A是_，为微生物的生长提供_，这种培养基属于_培养基。 (2)为了筛选出能产生纤维素酶的微生物，向培养基中加入_。,(3)在筛选出能产生纤维素酶的微生物之前，可用液体培养基培养，增加微生物的浓度。为获得纯净的菌株，常采用平板划线的方法进行接种，此过程所用的接种工具是_，操作时采用_灭菌的方法；还可用_的方法接种。 (4)实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理后才能倒掉，这样做的目的是 _。 答案 (1)纤维素 碳源 选择 (2)刚果红 (3)接种环 灼烧 稀释涂布平板 (4)防止造成环境污染,解析 (1)纤维素酶能将纤维素水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养，同样，也可以为人类所利用。要筛选到能产生纤维素酶的微生物，应用选择培养基，在培养基中加入纤维作唯一的碳源，能在此培养基中存活的微生物就是能产生纤维素酶的微生物。(2)刚果红可以和像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，而不与水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。纤维素分解菌能产生纤维素酶分解纤维素，从而使菌落周围形成透明圈。(3)获得纯净的菌株有两种方法，即平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线操作时所用的接种环，每次接种之前都要灼烧，这是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。(4)实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理后才能倒掉，这样可防止造成环境污染。,

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