内酰胺类抗生素2已课件

1、第一节 概述 第二节 青霉素 第三节 头孢菌素 第四节 其他重要的内酰胺类抗生素,第十五章 内酰胺类抗生素,抗生素是青霉素、链霉素、红霉素等一类化学物质的总称。是生物在生命活动过程中产生的，在低微浓度下有选择性地抑制或杀灭其他种生物机能的有机物质。 具有抗菌、抗肿瘤、杀虫除草、抑制生物体中某些酶类的作用，有些还具有某些药理活性，如强力霉素镇咳；新霉素降胆固醇,抗生素概述,抗生素的生产方法 生产主要采用微生物发酵法，属于次级代谢产物，少数如氯霉素、磷霉素亦可用化学合成法生产。,抗生素概述,半合成抗生素 将生物合成法制得的抗生素用化学或生化方法引入特定的功能基团进行分子结构改造而制成各种衍生物 增强抗菌力 扩大抗菌谱 对耐药菌有效 便于口服 减低毒副作用 改善药理性质、提高生物有效性,抗生素概述,抗生素的生物来源 放线菌：链霉菌、诺卡氏菌属、小单孢菌属 真菌：青霉菌属、头孢菌属、担子菌 细菌：多粘杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌 植物或动物：蒜蒜素；动物脏器鱼素,抗生素概述,抗生素化学结构的分类 -内酰胺类：青霉素类、头孢菌素类，包含一个四元内酰胺环 氨基糖苷类：链霉素、庆大霉素，既含有氨基糖苷，

2、也含有氨基环醇 大环内酯类：红霉素、麦迪加霉素，含有一个大环内酯作配糖体，以苷键和1-3个分子的糖相连 四环类：四环素、土霉素，以四并苯为母核 多肽类：多粘菌素、杆菌肽，含有多种氨基酸，经肽键缩合成线状、环状或带侧链的环状多肽,抗生素概述,抗生素的作用的分类 广谱抗生素：氨苄青霉素 抗革兰氏阳性菌抗生素：青霉素 抗革兰氏阴性菌抗生素：链霉素 抗真菌抗生素：制霉菌素 抗病毒抗生素：四环类抗生素 抗癌抗生素：阿霉素,抗生素概述,抗生素的作用机制 抑制细胞壁合成：青霉素、头孢菌素 影响细胞膜功能：多烯类抗生素 抑制病原菌蛋白质合成：四环素 抑制核酸合成：丝裂霉素C,抗生素概述,我国抗生素工业的发展 我国1953年设计制造了4个5吨发酵罐，建立上海第三制药厂，开始生产青霉素 1957年建立华北制药厂 经40多年来发展，国外有的基本抗生素品种我国都有生产，并已研制出国外没有的抗生素创新霉素等 截止1996年上半年，总计127个品种生产，总产量近几年3万吨，约占世界抗生素产量的1/4。 农用抗生素研究生产也获得了可喜的成绩，灭瘟素、春日霉素和有效霉素等。,抗生素概述,我国抗生素产品种类齐全。在抗生

3、素/抗菌素领域，我国具有一定的优势的是青霉素、四环素、氯霉素、土霉素、链霉素、螺旋霉素以及磺胺类产品，其中青霉素规模最大，我国青霉素年产量超过2.2万吨，约占全球市场的70%，2002年出口额达1.59亿美元，我国青霉素生产基本上集中于华药、哈药、石药和鲁抗四家，四家产量占国内青霉素总产量的75%。,抗生素概述,一、概况,第一节 概述,1929: Fleming在葡萄球菌培养皿中，污染的霉菌周围出现透明的抑菌圈。,杀菌物质，断言太不稳定，无法分离并用作药物。 1939：牛津病理家Howard Florey化学家Ernst Chain,Norman Heatley。发酵瓶培养霉菌，培养里提取，测活性，青霉素结晶。 1940:8只鼠注射链球菌，提取物对4只治疗。未经治疗鼠在24小时内死亡，治疗鼠存活数天至数周。 1941年2月开始治疗第一批人类病人。 1943：威斯康辛大学小组，取得突破,生产菌表面培养：几十个单位。 深层培养产黄青霉：100U/ml。 X、UV诱变育种：10001500U/ml。 不产色素变种：6600070000U/ml 目前：85000U/ml。,一、概况 内酰胺类抗

4、生素：含有-内酰胺环的抗生素 青霉素类，头孢菌素类、 硫霉素类、头霉素类、 单环内酰胺类 目前品种最多、使用最广泛的抗生素,第一节 概述,分子结构及衍生物,如6-氨基青霉烷酸（6-APA）：侧链基团不同，形成不同的青霉素 G：苄基青霉素，C6H5CH2-CO-，为主 双氢霉素F：戊青霉素 X：对羟苄基青霉素 F：2-戊烯基青霉素 K：庚青霉素 V：苯氧甲基青霉素 产品：钠、钾、普鲁卡因、二苄基乙二胺,-Lactams,青霉素类,头孢菌素类,头霉素类,碳青霉烯类,单环-内酰胺类,氧头孢烯类,结构中都含-内酰胺环，为抗菌活性之关键。,通过改造6-APA或7-ACA获得大量各具特点的抗生素。,第一节 概述,一、概况,一、概况,青霉素,s,o,s,c,青霉素 及 半合成青霉素类 青霉素类 2- 烯 O代S 青霉烯类 氧青霉烷类 C代S 碳青霉烯类,二、作用机制 1. 与细菌胞膜上青霉素结合蛋白(PBPs)结合，阻碍细胞壁肽聚糖合成，使胞壁缺损，菌体膨胀裂解。 2. 激活细菌自溶酶。,第一节 概述,三、临床应用的主要内酰胺类抗生素 青霉素类：天然青霉素（青霉素G、青霉素） 侧链改造（氨苄青霉素、

5、羟氨苄青霉素等） 头孢菌素类：天然头孢菌素（头孢菌素C、头霉素C） 半合成衍生物（头孢克罗、头孢西丁等） 碳青霉烯类： 天然（噻纳霉素等）衍生物（亚胺青霉烯等） 单环-内酰胺类：天然（单菌胺类）衍生物（氨曲南等）,第一节 概述,一、天然青霉素（主要有五种：G、V、X、N、K，临床常用G和V） 青霉素G：不耐酸，不耐酶 青霉素：耐酸，不耐酶，抗菌同G，活性较弱 工业上，用固定化青霉素酰化酶水解G或V来制备6-氨基青霉烷酸6-APA，再用化学或酶法添加侧链，获得半合成青霉素。,第二节 青霉素,二、菌种改良与保存 （一）菌种改良：点青霉（固）产黄青霉（沉没）70年代前诱变和随机筛选据合成途径理性化筛选原生质体诱变选育基因工程技术育种。现世界工业发酵水平达85000u/mL （二）菌株保存 真空冷冻干燥：分生孢子 甘油等悬浮-70或液氮：分生孢子或菌丝,第二节 青霉素,青霉素生产菌株原生质体诱变选育与生产应用 1992年，石家庄制药集团河北中润制药有限公司（原河北制药厂）生产菌株发酵效价和发酵指数低的问题。对青霉素生产菌产黄青霉进行了原生质体连续诱变，选育出了高产菌株。 按照计划，生产菌株JS

6、94-18为初发株原生质体诱变筛选JS94-18-58。1994年应用于生产，50吨发酵罐发酵203小时平均发酵单位49310u/ml，最高为53000u/ml，平均发酵指数为2.75Bu/hm3。发酵单位和发酵指数分别比原生产菌株提高了10.40%、11.79%。,第二节 青霉素,第二次以JS94-18-58为初发菌株原生质体诱变等H94-9-61菌株。菌落和菌丝形态发生了明显变化，新菌株菌落凸起、呈偏口状、菌褶增加，菌丝短粗、菌隔增多。1996年应用于生产，203小时平均发酵单位为52515u/ml，比JS94-18-58菌株提高了6.5%；发酵指数为3.05，比JS94-18-58菌株提高了10.91%。同时H94-9-61菌株对糖、氮的利用率高，对发酵液溶氧需求大大下降，增加了生产效率。 1996年之后，生产上一直使用H94-9-61菌株。随着菌种的进一步分离纯化和生产工艺的优化，使生产发酵单位稳定在56000-58000u/ml，发酵指数3.1-3.2。新菌株H94-9-61的应用，大大提高了生产效率，为企业新增加经济效益上亿元。,第二节 青霉素,二、菌种改良与保存,利用基因

7、工程技术对新生产菌种进行了改造，大幅度提高了菌种的生产性能，通过120吨发酵罐生产应用，发酵效价和发酵指数均提高到新水平。新菌种属于丝状菌，菌落直径较小，凸起较高，菌褶增多。该菌种产抗生素能力强，效价增长较快，165170小时效价可达到60000u/mL，192小时效价可达到70000u/mL以上（最高生产实验罐达到80000u/mL）。 新菌种平均发酵效价达到70000u/mL以上、发酵指数平均达到4.0Bu/hm3以上（最高生产实验罐达到4.6亿/小时立方米），该菌种的生产成本大幅度的下降，是目前青霉素发酵生产最为理想的菌种之一。,第二节 青霉素,二、菌种改良与保存,我国青霉素的质量标准、临床效果可以说基本上已与世界顶尖企业接轨，青霉素的产量已在国际市场上占到60的份额，再加上价格优势，中国产品的竞争优势自然不言而喻。 同时，我们也应当注意到，我国青霉素工业菌种的发酵能力，发酵指数和生产成本与国外企业相比还有很大差距，国外工业菌株发酵能力约是我国的1.8倍，其发酵成本仅占售价的25%，而我国发酵产品的生产成本占到售价的50%60%。这使得我国发酵产品的利润空间和发酵工业的赢利能力远

8、低于国外同类企业。我国更多是以规模生产在国际市场参与竞争。,第二节 青霉素,二、菌种改良与保存,（三）青霉素生产菌的生物学特性 产黄青霉：Penicillium chrosogenum 孢子：绿色和黄色 菌落：平坦或皱褶，圆 形。 青霉穗：分生孢子链状 深层培养菌丝：球状和 丝状两种。,发酵培养下的生长过程及细胞学变化 第1期：分生孢子萌发，具有小泡。 第2期：菌丝繁殖，嗜碱性，类脂肪小颗粒。 第3期：脂肪包涵体，贮藏物，嗜碱性很强。 第4期：空泡，嗜碱性减弱，开始产生抗生素。 第5期：大空泡，中性染色大颗粒，脂肪包涵体消失，青霉素产量最高。 第6期：个别细胞自溶，胞内无颗粒，释放氨，pH上升。 第7期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。,镜检控制 规定时间取样，显微镜观察7个时期的态变化，控制发酵。 14期为菌丝生长期，3期的菌体适宜种子。 45期为生产期，生产能力最强，通过工程措施，延长此期，获得高产。 第6期到来之前结束发酵。,三、青霉素发酵生产 （一）流程及工艺要点 冷冻干燥孢子琼脂斜面米孢子种子罐发酵罐过滤青霉素回收,第二节 青霉素,消沫剂,补料 C、N及前体,菌丝体,丰富的孢子,

9、大量健壮的菌丝体,生长阶段：使菌丝快速生长,生产阶段：用糖控制最低比生长速率，有利于青霉素大量合成,发酵工艺过程 1、生产孢子制备工序 斜面种子：砂土孢子用甘油、葡萄糖、蛋白胨组成的固体培养基进行培养 米孢子：移植到小米或大米固体培养基上，生长7天，25 注意：每批孢子必需进行严格摇瓶试验，测定效价及杂菌情况。,2、种子罐培养工艺 一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝。 培养基：葡萄糖，玉米浆，碳酸钙，玉米油，消沫剂等。空气流量1：3（体积比）；300-350r/min；pH自然，温度271, 40h 二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖。接种量10 培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等。 1:1-1.5；250-280r/min；pH自然，251。10-14h 质量：菌丝致密，菌丝粗壮，III期，倍增期6-8h,发酵工艺过程,3、生产罐培养工艺 三级罐：生产罐；接种量20 培养基：花生饼粉，葡萄糖，尿素，硝酸铵，硫代硫酸钠，苯乙酰胺，CaCO3, 玉米油, 硅油。 参数条件： 通气量1:0.8-1.2；150-200r/min； 前60小时：pH6.4-6.6，26； 60小时后：pH6.7，24。,发酵工艺过程,4、发酵培养与过程控制 操作方式：反复分批式发酵 发酵罐：100M3，装料80M3. 带放: 6-10次，带放量10，间隔24h。 发酵周期：180-220h,发酵工艺过程,（1）过程控制补料分批操作控制基质浓度 前40小时：培养基中的主要营养物 40小时后：低速连续补加葡萄糖、氮源和苯乙酸等，维持一定的最适浓度。 半饥饿状态：延长合成期，提高产量。 碳源占成本12以上，采用糖化液流加，降低成本。 糖与6APA结合形成糖基-6APA，影响青霉素产量。,流加碳源控制 根据残糖、pH、尾气中CO2和O2含量。 葡萄糖的波动范围较窄，浓度过低使抗生素合成速度减慢或停止，过高则导致呼吸活性下降，甚至引起自溶。 残糖0.3-0.6左右，pH开

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