1、第5节 苷的提取、分离及检识,苷的提取: 溶剂法 苷的分离: 大孔树脂法 色谱法 苷的检识: 化学检识 色谱检识,1.苷的提取,溶剂法:用极性由小到大的溶剂依次提取。常用溶剂有沸水、甲(乙)醇、正丁醇、乙酸乙酯等。 !注意:苷的水解(酸、酶、碱的影响)。 原生苷的提取:破坏或抑制酶的活性。 药材迅速干燥 拌料无机盐如碳酸钙 用沸水、高浓度醇提取 次生苷或苷元的提取:利用酶活性。 发酵后或水解后,用亲脂性有机溶剂提取。,2.苷的分离纯化,溶剂处理法:利用溶解度差异分离。提取液浓缩后,用合适的溶剂处理,根据苷类与杂质的溶解度不同分离。如乙醚、丙酮沉淀皂苷等。 铅盐沉淀法:利用醋酸铅在水或稀醇中能沉淀某类成分的性质,进行除杂或提纯。中性醋酸铅能沉淀具邻二酚OH、-COOH的酸性苷;碱式醋酸铅能沉淀酚性成分。 色谱法:利用混合物中各组分与固定相和流动相的相互之间的作用不同,使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中,当流动相流过固定相时,各组分以不同的速度移动,达到分离。分离效果好,是一种实验室常规分离方法。,按流动相分:液相色谱(liquid chromatography) 气相色谱(gas
2、chromatography) 按操作方式分:薄层色谱 纸色谱 柱色谱 按分离机理分:吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 按极性分:正相色谱 反相色谱,色谱法(Chromatography)分类:,2.苷的分离纯化,大孔树脂吸附色谱 原理:大孔树脂是一类具有多孔结构、不溶于水的固体高分子物质,可以通过物理吸附(范德华力)从水溶液中有选择的吸附成分,达到分离目的。 特点:选择性、机械强度高、再生处理方便、吸附速度快等。应用广泛,如苷与糖类的分离等。 分类:非极性、中极性、极性和强极性四类。选择的树脂极性与被分离物质极性既不能相似(吸附过强),也不能差太大(无法分离)。常用的有DA-101、DA-201、AB-8型等。 操作:样品用水溶解,上样后依次用水、含水醇、浓醇洗脱。收集洗脱液,回收溶剂,浓缩干燥,即得。 聚酰胺色谱 凝胶色谱,苷的分离(有效部位):,2.苷的分离纯化,硅胶、氧化铝吸附色谱:适用于极性低的苷类或苷元的分离。利用被分离组分与吸附剂之间的相互作用(可逆的范德华力)差异进行分离。在洗脱过程中,柱内不断地发生解吸、吸附,再解吸、再吸附的过程。即被吸附的物质被溶剂解吸而随溶剂向下
3、移动,又遇到新的吸附剂颗粒被再吸附,后面流下的溶剂又再解吸而使其下移动。经过一段时间以后,该物质会向下移动一定距离。此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力以及溶剂对该物质的解吸(溶解)能力有关。不同的物质由于吸附力和解吸力不同 ,移动速度也不同。吸附力弱而解吸力强的物质,移动速度就较快。 分配色谱:以硅胶、纤维素等为支持剂,水饱和的溶剂为流动相进行分离,适用于极性较大的苷类成分。常用反相色谱,即以键合硅胶为固定相,含水的溶剂系统为流动相分离。,苷的纯化(有效成分):,3.苷的检识,化学检识 Molish反应(-萘酚浓硫酸):糖、苷()紫色环。 糖被氧化成糠醛,糖醛与酚胺缩合生成有色化合物。 Fehling或Tollen反应:还原糖()。 苷、非还原糖(-)。比较水解前后结果,判断是糖还是苷。 RCHO+2Ag(NH3)2+OHRCOONH4+2Ag+3NH3+H2O RCHO+2Cu(OH)2+NaOHRCOONa+Cu2O+3H2O,第6节 苷的结构研究,纯度鉴定 分子式的测定 苷的水解 苷元的结构鉴定 糖的结构鉴定,糖的结构鉴定,糖的种类 糖的数目 糖链的结构 位置:苷元-糖、糖-糖
4、 顺序:糖-糖 构型:苷键,1.糖的种类的确定,色谱法测定水解液中的单糖,与对照品比较。 PC:最常用。 TLC:点样量较少5g。可用无机盐(强碱弱酸)的水溶液制板,增加样品承载量,改善分离效果。如0.3mol/L Na2HPO4、0.03mol/L H3BO3等。 HPLC:直接进样,但灵敏度不及GC。 GC:灵敏度高,但需水解、制备衍生物。 NMR法直接测定苷,与标准品的糖数据比较。 1HNMR、13CNMR 二维NMR,常见单糖纸色谱hRf,BAW:正丁醇醋酸水(4:1:5, 上层) BEW:正丁醇乙醇水(4:1:2) BBPW:正丁醇苯吡啶水(5:1:3:3) PhOH:水饱和苯酚,2.糖的数目的确定,MS法 测定苷和苷元分子量,根据差值或碎片质荷比差值计算。 色谱法测定水解液中的单糖 TLC-Scan、HPLC-定量,以单糖对照品为标准。 NMR法 1HNMR:根据糖端基质子信号数目确定;或全乙酰化、全甲基化数目推测。 13CNMR:根据糖端基碳信号数目(90-112ppm)确定;或苷和苷元碳信号差值推断。 二维NMR,3.糖的连接位置苷元与糖,13CNMR 苷化位移(gly
5、cosylation shift, GS):苷元与糖结合成苷后,苷元的成苷碳原子(-C)与相邻的碳原子(-C)信号会发生位移,其他碳信号不变;糖端基碳原子与游离单糖信号相比也发生了位移。 苷元:醇苷,-C 低场位移 4-10ppm -C 高场位移 1-4.6ppm 酚苷,-C 高场位移 -C 低场位移 糖:端基C低场位移 4-7ppm 相邻C高场位移 1-4ppm 二维NMR,13CNMR 法:苷的碳谱数据与单糖的碳谱数据比较,根据苷化位移规律可确定单糖的连接位置。若内侧糖的某碳原子向低场移动(4-7ppm),而相邻两个碳原子又略向高场移动(1-4ppm),确定内侧糖的碳原子是连接糖的位置。,4.糖的连接位置糖与糖,6.苷键构型的确定,酶水解法 麦芽糖酶水解 -苷键 苦杏仁苷酶水解 -苷键 NMR,1HNMR:糖成苷后,端基质子常位于较低场。 H-2为a键的糖,如葡萄糖,形成-苷或-苷时,偶合常数J不同,由此可判断苷键构型。 H-2为e键的糖,如鼠李糖,形成不同构型苷的J值相近,无法判断。,-L-鼠李糖苷 J12 = Jae = 2-3 Hz,-L-鼠李糖苷 J12 = Jae = 2-3 Hz,13CNMR:糖成苷后端基碳原子向低场位移,而其他碳变化不大。 2D-NMR(NOE) -D-葡萄糖苷,H1H2 -D-葡萄糖苷,H1H3、H1H5,复习思考题:,1.名词解释 苷 原生苷 次生苷 乙酰解反应 酶解反应 Smith降解 Molish反应 与构型 全甲基化甲醇解 苷化位移 端基碳 氧苷 2.比较以下各化合物水解难易,并说明理由。 ABDC,3.完成反应式 (1)写出苦杏仁苷在不同条件下的水解产物:a.稀酸;b.苦杏仁酶 (2)写出碳苷的Smith降解产物。 4.问答题 (1)简述苷键裂解的方法、使用范围及优缺点。 (2)如何从中药材中提取分离苷类成分,要注意哪些问题? (3)简述开展苷的结构研究的程序及方法。 (4)确定苷键构型的方法有哪些?,
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