植物病原菌致病机理研究进展级植物保护三班第三小组课件

1、水稻细菌性褐条病,目录,概述 水稻细菌性褐条病及其致病细菌 细菌IV型菌毛 细菌的VI型分泌系统 pilP基因在Aoryzae上的功能小结 Aoryzae RS-1的致病机理研究,概述,水稻细菌性褐条病的病原物早先被报道为丁香假单胞菌属致病变种(Pseudomonas syringae pvpanici(Elliott)，后来经深入比较研究，确定其病原物为Pseudomonasavenae。随着科学家对细菌分类的不断完善,Pseudomonas属中非荧光菌独立成多个属，其中avenae被归入嗜酸菌属(Acidovorax)并命名为Acidovorax avenae subspavenae。,值得一提的是，这个亚种中包含了引起麦类细菌性褐条病和引起水稻细菌性褐条病的病原，后来为了更明确起见，又将其中水稻细菌性褐条病的病原确立Acidovorax oryzae。根据最新的细菌分类及命名规定，在本实验中，将水稻细菌性褐条病原统一为Acidovorax oryzae，实验过程用到的菌株为由本实验室分离并保存的（Aoryzae RS-1）菌株。,水稻细菌性褐条病及其致病细菌,水稻细菌性褐条病的发

2、生与危害及其病原物 水稻细菌性褐条病的防治,水稻细菌性褐条病的发生、危害及其病原物,我国的水稻细菌性褐条病主要发生在南方地区，在广东、广西、福建、四川、浙江、江苏、江西、湖南、湖北及台湾等地区均有发病记录；近年来，这种病害有蔓延至北方稻区的趋势;。 发病初期，叶片或叶鞘上出现近圆形褐色小斑点，随着发病严重，斑点逐渐扩展呈边缘清楚的褐色长条斑，并蔓延到整个植株。 严重时整个颖壳变褐，并深入米粒使之呈褐色，多秕谷，甚至颗粒无收。,水稻细菌性褐条病的防治,在综合防治方面，需要搞好农田基本建设，加强田间管理，建立合理的排灌系统，这样可以有效避免洪水发生时淹灭稻田。另外，灌溉时要防止深灌积水以避免稻株相互感染。对于已经被淹没的农田，应该及时排水晒田，清洗泥沙，防止病害流行。对于初发病或发了病的田块，要立即每亩撒施石灰或草木灰30-40斤，同时喷洒农用链霉500-600倍液。,细菌IV型菌毛,细菌菌毛的生理功能和分类 细菌IV型菌毛与细菌的游动性、生物膜形成以及致病性的关系,细菌菌毛的生理功能,菌毛(Pilus)存在于大多数革兰氏阴性菌及少数革兰氏阳性菌的细胞表面。与鞭毛相比，他们通常更细、更短而

3、且直硬,可将其分为两大类普通菌毛(Common Pili)和性菌毛(Sex Pili或Conjugal Pili)性菌毛比普通菌毛略粗。,细菌通过细胞的暂时沟通而将遗传物质转移，这个过程叫做“接合(Conjugation)”。 大量的实验证据显示，性菌毛是细菌接合时遗传物质的通道：性菌毛与与接受细胞(Recipient Cell)上的受体蛋白(Receptor Protein)结合，去聚(Depolymerisation)作用产生，性菌毛缩短，将两个细胞拉近，质粒或者染色体DNA可通过性菌毛的桥梁作用转移到另一个细胞中。,普通菌毛长0.3-1.0um，直径约为7 nm，通常每个菌体上分布有1501500个，散布于细菌的表面，目前已根据菌毛的数量，形态，分布情况，附着力，抗原性等特点。,细菌菌毛的分类,将普通茵毛分为IVI这六种类型。 I型和VI型菌毛可以直接凝结人或动物的红细胞，又根据是否能被D甘露醇抑制而分为甘露醇敏感血凝和甘露醇耐受血凝两类。具有I型菌毛的细菌多为前者，而具有VI型菌毛的细菌多为后者以大肠杆菌为例，I型菌毛主要由Fim A，Fim F，Fim G，Fim H等蛋白构

4、成，其中Fim H蛋白是作为受体蛋白，使细菌细胞与其寄主细胞的D甘露糖互作，从而帮助细菌定殖在肠粘膜的表面，继而诱发了肠道疾病,一些沙门氏菌属的细菌具有II型菌毛。但尚未发现其具有血凝作用。,有些克雷伯以及沙雷氏菌属细菌有一种比较纤细的III型菌毛，可以直接黏附在真菌、植物细胞甚至玻璃的表面，但是不能黏附于动物细胞。因此，D-甘露醇对此类血凝没有抑制作用(MRHA)。IV型菌毛大多能引起甘露醇抵抗性血凝，即MRHA。不同于其他几种类型的周生菌毛，V型菌毛为丛生菌毛。,IV型菌毛组成结构,细菌IV型菌毛与细菌的游动性的关系,早在上世纪70年Henrichsen等研究表明细菌在固体表面运动的能力，即细菌的“游动性(Twitching Motility)”，是由IV型菌毛的收缩产生的，它是细菌表面的一种移动方式，细菌通过这种方式产生菌落边缘的菌圈 。细菌的吸附和在寄主细胞上的定殖能力是其侵染寄主、使寄主致病的第一步。 当细菌细胞单个存在时，并没有游动能力。,细菌IV型菌毛与生物膜和致病性形成的关系,生物膜是细菌在物体表面形成的高度组织化的多细胞结构，是细菌为了适应环境而采取的一种生存方式，可

5、以帮助细菌逃避机体免疫和抗菌药物的杀伤作用。,细菌的VI型分泌系统,细菌的分泌系统和VI型分泌系统的发现； T6SS的结构组成；,细菌的分泌系统和VI型分泌系统的发现,细菌的分泌系统(Secretion System)是一个类似于注射器一样的结构，它与细菌的致病性密切相关。致病性细菌通过分泌系统将胞外蛋白或效应蛋白运送入外界环境，或者直接作用于寄主细胞的靶位点，使宿主致病。 细菌VI型分泌系统(Type VI SecretionSystem，T6SS)是最近才被发现和研究的一种分泌系统，广泛存在于革兰氏阴性致病菌中。,T6SS的结构组成,T6SS是由一系列蛋白组成的复合体，按照蛋白功能的不同可分为结构蛋白，效应蛋白，调节蛋白和分子伴侣蛋白.。典型的T6SS由15-25个保守的开放阅读框组成，并由这些基因编码的蛋白组成跨膜结构，由Icm F和Dot U等蛋白构成的结构横跨细菌细胞内膜-周质-外膜，并将效应蛋白分泌和转运出去，直接到达宿主细胞内。 虽然这些基因的转录方向不完全相同，但是都有13个保守的核心元件组分和T6SS基因簇编码的辅助原件构成。,T6SS结构组成,Aoryzae突变体的

6、构建和回补,单交换同源重组构建pilP、icmF、dotU基因的插入突变:经过PCR、测序鉴定后，最终得到突变体菌株。 通过这种方法，得到了pilP、icmF、dotU基因的突变体，并分别命名为RS-P、RS-F、RS-D。,pilP基因在Aoryzae上的功能小结,敲除pilp基因后，Aoryzae致病性显著下降； pilp基因缺失后，细菌丧失菌圈和Iv型菌毛； pilp基因能够影响Aoryzae的游动性及生物膜形成。,水稻细菌性褐条病菌Aoryzae中icmF和dotU基因的相互作用,T6SS能够影响Aoryzse细菌致病性:表明icm F和dot U基因可以影响Aoryzae的致病性，当基因缺失时，细菌表现为弱致病性.,Aoryzae RS-1的致病机理研究,pilP基因能够通过影响细菌IV型菌毛形成，继而影响细菌的游动能力、生物膜形成和致病性。Aoryzae作为一种致病细菌，其最重要的功能之一就是侵染寄主使之生病。 通过IV型菌毛使细菌在寄主细胞表面定殖是它侵染寄主的第一步，而pilP基因则是IV型菌毛合成和装配过程中起到重要作用的pilP MNOPQ操纵子中的一员。, 在本研

7、究中，通过单交换同源重组，利用自杀质粒p JP5603，构造了pil P基因突变体。将该突变体菌株接种水稻后，细菌的致病力明显降低。通过光学显微镜和透射显微镜发现，当该基因的功能缺失时，Aoryzae无法形成正常的典型的菌圈，也无法形成完整的周生菌毛； 软琼脂培养基实验表明细菌的游动能力大幅下降； 细菌生物膜测定结果表明pil P基因突变体的生物膜形成数量显著降低。,此项研究为我们防治水稻细菌性褐条病提供了一种很好的思路：将细菌菌毛作为药剂的靶标位点，对该病害的防治或将起到良好的效果。,Aoryzae RS-1的致病机理研究,T6SS的核心基因icm F和dot U可以影响细酋TS66的功能以及致病性，这两个基因之间存在互作关系。细菌的VI型分泌系统是近些年才被发现的一种新型分泌系统，在Aoryzae中也存在着T6SS结构。,在其中的保守元件中，Icm F和Dot U是两个关键的核心蛋白。通过单交换同源重组，利用自杀质粒p JP5603，构造了icm F和dot U基因突变体。将这两个突变体菌株接种水稻后发现，其致病力均有所降低。 利用细菌双杂交和双分子荧光互补分析，表明了icm F和

8、dot U基因之间存在相互作用关系。这为此后更加系统的研究T6SS的结构和功能提供了基础。,芸薹根肿菌致病机理研究进展（附）,芸薹根肿菌,芸薹根肿菌 (Plasraodiophora brassicae Woron)是 一 种土传性活体寄生菌，专性寄生于十字花科植物，导致根肿病的发生。,受害寄主植株感病初期地上部无明显差异或特殊的表现，而在感病后期，地上部叶片由下而上逐渐发黄，出现持续性失水萎蔫。 相较于正常植株，感病株生长缓慢，株型矮小，地下部主根、侧根和须根上形成数目和大小不等、呈指状 、短棒状或球形的 肿瘤 ，根肿发生初期表面光滑 ，后期则会 出现龟裂 、粗 糙 、变黄 ，最后整个受害根部组织 出现腐烂 ，滋生各种 真菌，形成白色的菌丝层或滋生多种害虫，地上部植株枯萎死亡。,激素与芸薹根肿菌致病的关系,G-rsic等“研究表明，吲哚乙酸合成中起关键作用的腈水解酶活性及其mRNA转录水平明显增强，之后他们对腈水解酶基因的拟南芥突变株系研究发现，突变株相较于对照更加耐受芸薹根肿菌的侵染。 有活性的吲哚乙酸的另一个来源是结合态的吲哚 乙酸在水解酶的作用下水解成自由态的吲哚乙酸。,G-r

9、sic等研究发现芸薹根肿菌侵染寄主时 ，该水解酶活性显著增强，甚至认为芸薹根肿菌能合成产生结合态吲哚乙酸水解酶。 除生长素合成增量增加外，生长素运输相关基因在根肿菌侵染时期也上调表达。,Sylvie等将生长素运输蛋白alm1基因敲除后 ，突变株表现为增强对根肿菌的耐受性，在根肿菌侵染32天后 ，其根肿大小仅为对照植株的三分之一。 以上研究表明，生长素在芸薹根肿菌的致病过程中起着不可替代的重要作用，然而十字花科植物生长素的生物合成途径有很多，它们之间相互联系，并在植物生长发育的不同阶段和不同的胁迫环境中起作用。,有研究结果显示 ，根肿组织里的自由态和结合态细胞分裂素浓度是正常根组织中的23倍； Dekhuijzent 发现寄主细胞质与根肿菌的原质团存在细胞分裂素(CTK)差异，在病原菌原质团中主要以玉米素核糖苷及其葡萄糖的衍生物形式存在 ，而寄主细胞质中则为玉米素核糖苷、少量的玉米素以及玉米素葡萄糖磷酸盐衍生物；,Miiller和 Hilgenberg发现，在接种休眠孢子23天后，寄主植株中分离得到的次级原质团可以将 C 标记的腺嘌呤同化为反玉米素。 以上研究结果可以得出结论，在侵染后期，芸薹根肿菌自身能合成细胞分裂素并释放到寄主细胞质中。,转录组学研究证明，细胞分裂素氧化酶脱氢酶基因的表达在根肿形成过程中受到了抑制 ，使得 CTK的降解能力下降，而根肿菌在不断合成CTK的同时CTK降解酶活性受到抑制，直接导致了CTK的不断累积，引起寄主根细胞的无序分裂，最终形成根肿。,Sylvie等将细胞分裂素及生长素合成启动子分别 与GUS报告基因重组转化至拟南芥 ，通过GUS染色 的方法 ，发现芸薹根肿菌接种寄主4天后，异戊烯基腺嘌呤浓度是对照植株的2倍，此时的自由态和结合态吲哚乙酸浓度则与对照没有差别，持续侵染6天后 ，吲哚乙酸的浓度开始高于对照，结合前人的研究，JuRa 等提出了激素和代谢平衡假说来解释芸薹根肿菌致病机理 。,即芸薹根肿菌引起寄主致病是由细胞分裂素及生长素共同作用所致。 二者对寄主的影响主要有两个方面 ：,其一 ，芸薹根肿菌侵染寄主后，在皮层侵染期合成或产生细胞分裂素，导致细胞无序分裂增生， 病原菌和无序增生的细胞可能引起生长素的富集 ，进而加剧的根瘤的膨大 ；

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