二聚体的检测及临床应用

1、D-Dimers测定及临床应用,D-Dimers定义,D-Dimers ：是纤维蛋白单体经活化因子XIII交联后，再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物。 是一个特异性的纤溶过程标记物。,纤维蛋白形成,纤维蛋白降解,一、D-二聚体的形成,FEU(340KD),DDU(190KD),所检测的D-二聚体片段,DDU与FEU,DDU反映的是小分子片段(195KDa)D-二聚体的量，其校准物使用的是纯化的或部分纯化的D-二聚体片段 FEU反映的是大分子片段(340KDa)D-二聚体的量，其校准物使用的是标化的纤维蛋白原水解生成的交联纤维蛋白降解产物，故用降解前纤维蛋白原分子的量来表达 用FEU表达的D-二聚体的量相当于用DDU表达的1.7倍，但不建议进行形式和量纲的转换 国外研究显示，用FEU表达D-二聚体检测量更能反映病人的实际情况,D-二聚体检测的应用现状,制备的单克隆抗体，针对的只是某种类型D-二聚体。 病理过程中可产生多种类型的D-二聚体，由于不同的检测试剂只能测定其中某种类型，而不是测定所有的降解片段， 因此各类试剂在对同一标本进行测定时，其敏感性显著不同。 目前，有多达30种检测

2、方法（20余 种单克隆抗体试剂）被应用于临 床，不同试剂间差异非常显著。,D-二聚体检验方法的演变,由于低敏感度方法导致许多病理状态无法及时反映。 2007年美国医师学会（ACP）和美国家庭医师学会 （AAFP）发布了静脉血栓栓塞症的诊断、治疗和预防 的临床实践指南。Ann Intern Med.2007,5:57-62.Ann Intern Med. 2007,146:204-210. 2008年欧洲心脏病学会（ESC）急性肺栓塞诊疗指南。 Eur Heart J, 2008;29(18):2276-2315. 急性肺血栓栓塞症诊断治疗专家共识中华内科杂 志2010年1月。 推荐使用中高敏感度的方法 国际上目前已经普遍采用高敏方法。 老的方法敏感度低：阳性率低 新方法敏感度高：阳性率高 临床：与既往的使用经验不符,D-二聚体临床应用进展,随着技术的进步，临床应用也在不断深入 早期检测D-dimer主要是用于替代FDP和3P实验用于DIC的诊断和监测 现在D-dimer高阴性预示能力和高灵敏度，主要用于VTE排除、早期DIC的诊断和溶栓治疗监测 VTE复发的监测，抗凝药物停药的风险评估

3、 内、外、妇、儿多种疾病血栓风险评估、病程动态监测 及预后评估 恶性肿瘤的预警信号.,无统一的国际标准 目前有超过30种检测方法和20多种单抗被使用。 存在两种报告单位： D-dimer（DDU）和纤维蛋白原当量(FEU) 抗体对D二聚体不同片段有不同的亲和力 不同的试剂有不同的干扰情况,13,二、D-二聚体检测标准化问题,排除静脉栓塞的试剂要求,建立排除诊断的阈值（cutoff值） 必须有高的阴性预示值、灵敏度 必须在阈值浓度水平有较好的重现性 厂家应提供主要特征评估的数据来源,CLSI 59-A（2010）推荐的预测值特征：,15,D二聚体试剂标准中国国家标准（讨论稿）,4.2 阴性预测值 结合临床诊断的验前概率进行D-二聚体检测，其阴性预测值应不低于95%。 4.3 测试范围 涵盖制造商提供的用于排除诊断的临界值的1/2到4倍的临床标本测定值。 4.4 线性 D-二聚体试剂在测试范围内，线性相关系数应大于0.98。 4.5 精密度 4.5.1 重复性 用正常质控血浆同日内重复测试所得结果的变异系数（CV）不超过15，用高值异常质控血浆同日内重复测试所得结果的变异系数（CV）不超过

4、10。 我国正在制定有关D-二聚体检测的质量管理规范,16,4.7 报告方式 D-二聚体的报告单位通常包括纤维蛋白原等量单位（FEU） 和D-二聚体单位（DDU）两种形式。FEU是将D-二聚体的量用 降解前纤维蛋白原分子的量来表达，因此，用FEU表达的D-二聚体的量相当于用DDU表达的1.7倍。在D-二聚体报告方式中还包 括ng/mL、ug/mL和mg/L等形式，通常应该直接采用制造商提 供的单位，不建议进行形式和量纲的转换,17,D-Dimer检测技术和应用的发展,Gaffney首先提出 D-Dimer检测，可作为监测凝血性疾病的“有用的工具”,Rylatt等首先报道了用单克隆抗体DD-3B6/22） 检测D-Dimer（乳胶凝集法），进入临床应用,ELISA分析法、乳胶增强型免疫分析法等,免疫比浊法在凝血仪上实现了自动化检测,（1）胶乳凝集法：经典胶乳凝集法是将被检血浆中D-二聚体或FDP与包被在乳胶颗粒上的单克隆抗体发生抗原-抗体反应，产生肉眼可见的凝集反应，进行定性或半定量测定（FDP5mg/L、 D-二聚体250g/L）。 该法操作简便、快速、经济，适用于床旁检测，常作为筛查

5、试验用。为定性试验，半定量时费试剂，结果判断有主观差异，敏感性和NPV低于ELISA.,（2）自身红细胞凝集法：自身红细胞凝集法采用分别针对D-二聚体和红细胞膜上双表位抗体，当血中D-二聚体水平升高时，抗原-抗体结合的增多而导致红细胞凝集，2min内可以判断结果，为半定量的自身红细胞凝集试验。 其优点是可用全血检测，省去了离心制备血浆的麻烦。缺点是敏感性低和不能定量。,（3）胶体金免疫渗滤反应法：该法是将单克隆抗体吸附在多孔薄膜并粘放在有多层吸收垫的塑料盘上，被检标本加入后即与该抗体结合，然后加入胶体金标记的抗体，形成抗体-抗原-金标抗体复合物在薄膜上即产生紫红色沉淀，紫红色强度与血浆中抗原成比例，在几分钟内即可完成。 该法易受白细胞、血小板、类风湿因子、肝素及血脂等物质的干扰，特异性不强，在不同的报道中其敏感性和阴性预测值（NPV）差别较大，并且厂商和实验室的结果存在较大的差异。,（4）酶联免疫吸附法（ELISA）：ELISA法检测原理是包被在固相载体的抗人D-二聚体或FDP抗体与待测标本中抗原结合，再加入酶标抗体后形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，再加入底物呈显色反应，测得的吸光度值

6、与标本中抗原量成正比。 该法具有灵敏度高、定量准确等特点，但经典ELISA法操作步骤复杂、费时，影响因素较多，不适合急诊使用。,（5）胶乳增强型免疫比浊法：胶乳免疫比浊法是样本中抗原与包被在胶乳颗粒上的单克隆抗体发生抗原-抗体反应，在一定的缓冲体系中产生凝集而导致浊度增大，浊度的变化率与抗原浓度成正比。 目前，已有多种全自动血凝仪用于免疫比浊法D-二聚体和FDP的检测，整个检测过程可以由仪器自动完成，检测效率高，除去准备标本的时间，一般只要5min便可报告准确的定量结果。该法有操作简便、快速、定量准确、敏感度高等优点，可满足急诊需要，在临床研究中应用越来越广泛。但需要专门仪器，成本高。,D-dimer检测方法的比较,方法 单份标本检测 快速 定量 敏感性 特异性,乳胶凝集法 + + - - -,自身红细胞凝集法 + + - +/- +,ELISA - - + + +,乳胶增强免疫 + + + + + 比浊法,免疫渗率试验 + + + +/- +/-,D-Dimer含量问题,1 纤维蛋白的结构不同产生的D-Dimer含量也不同 2 同一种血栓，由于III因子含量不同，所产 生的D-Dim

7、er含量也不同 3 血栓的大小、形成时间的长短，所产生的D- Dimer片段大小不同 4 不同的仪器，检测不同的Dimer片段,D-Dimer特点,1 敏感性高: 92%-100% 当血浆D-二聚体低于某一临界值时（通常为 500ug/L），可基本除外急性PTE(肺血栓栓 塞症 )，其阴性预测值大于90%。但也要注意假阴性结果。 2 D-Dimer特异性低：老年、孕妇、外周血 管疾病、肿瘤和感染性疾病等都可增高。,27,三、 D-二聚体检测的临床应用,深静脉血栓、肺栓塞（早期排除诊断） DIC的早期诊断和动态监测 外科手术后的血栓监测 妊高症、先兆子痫的监测 恶性肿瘤、白血病 早期识别、血栓监测 肝脏疾病（重症肝炎、肝硬化） 肾脏疾病（肾病综合征、肾移植术后） 溶栓治疗评估及血栓复发的监测 心血管疾病病情评估（心力衰竭、房颤、旁路手术） 脑梗死鉴别和治疗监测 严重感染,1.DVT和PE的排除,应用 -二聚体检测结果能够明确排 除 或 的患者，不需要再做进一步地检查，这样可以避免应用静脉造影术等一系列创伤性的检查，避免或减少给患者带来的不必要的伤害。-二聚体检测结合临床表现可有效地排除

8、，已得到循证医学的证实。对于已确诊为 、 的患者，通过对体内 -二聚体浓度的动态监测，还可用于对血栓性疾病治疗效果的观察，如经溶栓治疗后体内 -二聚体浓度呈迅速下降，提示治疗有效；如经溶栓治疗后体内-二聚体浓度没有明显下降，而呈持续升高或下降缓慢，则提示溶栓治疗药物的用量不足或有其他原因存在。,1.DVT和PE的排除,目前，-二聚体检测由于对 的诊断特异性不高，主要是用于 和 的筛查和排除。因此，-二聚体检测存在一定的局限性。据文献报道，引起静脉血栓栓塞发生的基础疾病如外科手术、创伤、肿瘤、妊娠和严重感染等多种疾病，均可引起机体凝血状态、血液流变学改变，进而导致机体血栓形成和纤溶功能紊乱，表现血浆 -二聚体浓度一定程度的变化。同时，-二聚体浓度与血栓的大小和其活动度相关，而且随着临床对抗凝药物的使用，其敏感性逐渐降低，此时检测 -二聚体意义不大。有文献报道，为了提高 -二聚体检测对 诊断的特异性，对怀疑患有 的老年患者，应该使用年龄校正 -二聚体临界值，以提高诊断的准确性。因此，对于 的诊断，如何在不改变 -二聚体检测灵敏度的同时又进一步提高特异性，还有待进一步研究。,Cut off,

9、sensitivity,aspecificity,D-Dimer Cut-off definition,1、用于排除DVT ，而不是诊断DVT 2、用于排除PTE ，而不是诊断PTE 3、在可疑VTE患者中的其它应用 （1）在无症状的高危患者中筛选DVT/PTE （2）诊断复发VTE 4、在DIC诊断中的意义 5、溶血栓治疗的监测,D-D检测的临床应用原则,肺血管造影,VTE中国发病率趋势,中国肺栓塞年住院发生率:0.1% ,推估每年有26万人罹患肺栓塞 (vs.美国肺栓塞年住院发生率0.3-0.4%)。 男性明显高于女性，而年龄越大其肺栓塞发生率也呈倍数上升。肺栓塞发生率和死亡率与地域分布有关，北方发病率高于南方，但死亡率低于南方。,VTE中国发病率和致死率,2.弥漫性血管内凝血（DIC）的诊断,DIC的主要病理过程为广泛性小血管血栓形成、继发性纤溶功能增强，且进入到DIC中后期时，患者机体内凝血功能逐渐减弱，而纤溶系统渐渐的处于极度活跃状态。 由此可见，加强对纤溶相关性指标进行实验检查，对于DIC的诊断具有重要意义和价值，尤其对于中后期的DIC，纤溶相关性指标实验检查结果的诊断准确率极高。DD本质属于蛋白质，由纤溶酶作用于交联纤维蛋白后分解产生，和纤维蛋白原均为继发性纤溶的敏感指标。当体内继发性纤溶功能异常活跃时，DD血浆水平会呈升高状态，,2.弥漫性血管内凝血（DIC）的诊断,故可将其视为纤溶功能增强亢进及血液高凝的极具诊断价值的分子标志物；机体内一旦出现

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